廣西不同品種牛促性腺激素釋放激素在下丘腦-垂體-性腺軸的免疫組化定位及其受體序列分析.pdf

1、本研究采用HE染色、IHC染色、RT-PCR技術(shù)對摩雜一代水牛、廣西沼澤型水牛、荷斯坦奶牛、廣西本地黃牛GnRH的分布表達(dá)迸行對比研究，并分別在品種、性別之間對GnRH及其受體進(jìn)行對比定位和表達(dá)研究，為水牛改良得到較強(qiáng)生產(chǎn)繁殖性能提供組織形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)。
　　 通過實(shí)驗(yàn)本論文得到主要的研究結(jié)果如下：
　　 實(shí)驗(yàn)一GnRH在不同品種牛的下丘腦中的IHC定位
　　 1．研究表本地公黃牛下丘腦各

2、核團(tuán)GnRH陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)最少，荷斯坦公牛最多。本地母黃牛各核團(tuán)GnRH陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)最少，荷斯坦母牛和摩拉雜交母水牛最多，提示下丘腦各核團(tuán)中GnRH免疫陽性細(xì)胞的多少與牛的生產(chǎn)性能有關(guān)系，GnRH陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)可能可作為選種的重要指標(biāo)依據(jù)。
　　 2．GnRH在不同生產(chǎn)性能牛下丘腦中分布廣泛，最主要分布在弓狀核、視上核、乳頭體核和室旁核等核團(tuán)。提示這四個(gè)核團(tuán)與GnRH的合成密切相關(guān)。本地母黃牛陽性細(xì)胞最小(P<0.05)，荷斯坦母牛

3、最大。本地公黃牛GnRH陽性細(xì)胞較小，摩拉雜交公水牛最大，提示GnRH陽性細(xì)胞大小可能與動(dòng)物性腺的發(fā)育、生理機(jī)能的產(chǎn)生有關(guān)。
　　 3．研究結(jié)果顯示，在摩拉雜交公水牛弓狀核、沼澤型公水牛腹內(nèi)側(cè)核同其他品種牛圖像平均光密度差異顯著(P<0.05)。荷斯坦母牛在多數(shù)核團(tuán)同其他品種母牛比較差異顯著(P<0.05)。提示GnRH陽性物質(zhì)在不同生產(chǎn)性能、性別牛下丘腦部核團(tuán)的分布有差異。
　　 實(shí)驗(yàn)二GnRH在不同品種牛的垂體中的I

4、HC定位
　　 1．在不同生產(chǎn)性能品種牛腺垂體中分布不等的GnRH陽性物質(zhì)，摩拉雜交母水牛較其他三品種高，且差異顯著(P<0.05)。公牛中，摩拉雜交公水牛腺垂體中陽性細(xì)胞最大，差異顯著（P<0.05），其細(xì)胞大小、平均光密度值不同提示GnRH在不同生產(chǎn)性能和不同生理期的機(jī)體內(nèi)分泌環(huán)境有關(guān)。
　　 2．在神經(jīng)垂體中未發(fā)現(xiàn)GnRH陽性細(xì)胞，但發(fā)現(xiàn)陽性纖維。另外在腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部細(xì)胞均呈GnRH免疫反應(yīng)陽性。提示GnRH對腺垂體

5、激素分泌可能直接通過神經(jīng)調(diào)節(jié)，而神經(jīng)垂體可能只是其調(diào)節(jié)過程的通路。
　　 實(shí)驗(yàn)三GnRH在不同品種牛的性腺中的IHC定位
　　 1．在卵巢內(nèi)，陽性細(xì)胞主要為顆粒層細(xì)胞和黃體粒細(xì)胞。在睪丸中，陽性細(xì)胞主要存在于間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞。提示其在生殖調(diào)控中可能直接和生殖器官發(fā)生作用，調(diào)節(jié)這些細(xì)胞和器官的功能。
　　 2．通過比較顯示在卵巢中陽性細(xì)胞大小方面荷斯坦奶牛陽性細(xì)胞和摩拉雜交水牛、本地黃牛相比差異顯著(P<0.05

6、)，四種不同生產(chǎn)性能的牛就細(xì)胞陽性個(gè)數(shù)差異極顯著(P<0.01)，摩拉雜交母水牛陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)最多，而平均光密度無顯著差異性。本地黃牛睪丸中陽性細(xì)胞最小，差異顯著(P<0.05)，細(xì)胞陽性個(gè)數(shù)差異極顯著(P<0．Ol)，以荷斯坦奶牛陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)最多。提示他們在性腺的分布差異可能與生產(chǎn)性能有關(guān)。
　　 實(shí)驗(yàn)四不同品種牛的HPG軸中GnRH-R mRNA的表達(dá)及序列分析
　　 1．RT-PCR研究方法表明，在牛HPG軸中，以垂

7、體中的GnRH-R mRNA水平最高，并且在在分泌GnRH的下丘腦神經(jīng)元上也存在GnRH的特異性結(jié)合位點(diǎn)，提示腦內(nèi)存在GnRH自分泌調(diào)節(jié)機(jī)制，垂體中以腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部邊緣區(qū)表達(dá)量最高，主要分布表達(dá)在LH和FSH的促性腺激素細(xì)胞上這表明GnRH主要作用于腦垂體通過旁分泌或自分泌而調(diào)控促進(jìn)Gnt的合成與釋放，從而對牛的發(fā)情和繁殖性能進(jìn)行調(diào)控。
　　 2．在性腺均有GnRH-R基因表達(dá)。經(jīng)序列分析顯示和垂體中的GnRH-R cDNA序列相

8、一致。通過IHC在性腺組織中發(fā)現(xiàn)有GnRH陽性細(xì)胞存在，提示GnRH在性腺水平發(fā)揮著自分泌及旁分泌作用，也可直接或間接參與性腺類固醇的功能活動(dòng)，調(diào)節(jié)性腺器官和細(xì)胞的功能。
　　 3．經(jīng)灰度分析比較得出GnRH-R mRNA的表達(dá)量高低順序依次為：垂體高于性腺高于下丘腦。荷斯坦母牛GnRH-R mRNA的表達(dá)率較其他母牛高，摩拉雜交公水牛較其他公牛高。試驗(yàn)得出GnRH-R mRNA核苷酸長1008bp，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物GnRH-R cDN

9、A結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的保守性，荷斯坦奶牛、摩拉雜交水牛、本地沼澤型水牛和廣西黃牛與己公布的美國牛屬動(dòng)物GnRH-RcDNA序列分別高達(dá)99.4％、99.2％、99.1％、97.7％的同源性。
　　 綜上所述，GnRH及其受體在HPG軸均有表達(dá)，不同品種牛表達(dá)量不同，所測陽性細(xì)胞大小、陽性面積、平均光密度數(shù)據(jù)顯示，選種時(shí)母牛中以荷斯坦奶牛最好，公牛以摩拉雜交公牛最好。本實(shí)驗(yàn)首次用RT-PCR方法對四種牛GnRH-R進(jìn)行了擴(kuò)增并對其序列同