Hsp70介導(dǎo)IUGR仔豬早期免疫功能損傷的機(jī)理及谷氨酰胺的營養(yǎng)調(diào)控研究.pdf

1、子宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)在人類醫(yī)學(xué)上是一個難題,由于在豬生產(chǎn)上具有高發(fā)率(15-20％),同樣給畜牧生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失.本試驗研究IUGR對新生仔豬免疫功能以及hsp70 mRNA和蛋白表達(dá)的影響；采用RNA干擾技術(shù),研究Hsp70介導(dǎo)IUGR仔豬早期免疫功能損傷的機(jī)理,并從營養(yǎng)學(xué)的角度,研究谷氨酰胺對斷奶IUGR仔豬免疫功能和Hsp70表達(dá)的影響,探討IUGR對新生仔豬出生后生長發(fā)育的影響,并分別從分子生物學(xué)角度和從營養(yǎng)學(xué)角度探討Hs

2、p70介導(dǎo)NF-κB免疫信號通路損傷的機(jī)制和谷氨酰胺對IUGR新生仔豬出生后生長發(fā)育的影響,為養(yǎng)豬生產(chǎn)和人類醫(yī)學(xué)研究提供理論依據(jù)和調(diào)控技術(shù)手段.
　　 1、IUGR對新生仔豬免疫功能和腸道黏膜Hsp70和FoxO3a表達(dá)的影響
　　 選擇15頭正常體重仔豬(NBW)和15頭IUGR仔豬,分別在出生(0日齡)和7日齡時屠宰取樣(n=5),分別測定出生體重、腸道重量、腸道絨毛高度、隱窩深度、血清及腸道黏膜中的細(xì)胞因子水平,以

3、及腸道黏膜中Hsp70和FoxO3a的表達(dá).試驗結(jié)果表明:
　　 (1)在0日齡和7日齡時IUGR仔豬體重和各段腸道的絕對重量極顯著低于NBW仔豬(P<0.01).IUGR仔豬空腸前段和回腸的相對重量顯著低于NBW仔豬(P<0.05).此外,IUGR可導(dǎo)致仔豬各段腸道絨毛萎縮(P<0.05或P<0.01),絨毛高度與隱窩深度比值降低(P<0.05).在7日齡時,與NBW仔豬相比,IUGR仔豬外周血T淋巴細(xì)胞和 B淋巴細(xì)胞的增殖顯

4、著降低(P<0.05),血清IgG含量低于 NBW仔豬20.8％(P<0.05),血清IgM含量同樣有降低的趨勢,但差異不顯著。IUGR仔豬血清和回腸中IFN-γ和IL-10含量低于NBW仔豬(P<0.05),但對IL-8沒有影響.此外,與NBW仔豬比較,IUGR仔豬血清中IL-4含量極顯著降低35.0％(P<0.01),但腸道中IL-4的水平反而提高了31.0％(P<0.05).
　　 (2)在0日齡時,IUGR仔豬空腸前段和

5、空腸后段hsp70 mRNA的表達(dá)顯著高于NBW仔豬(P<0.05),在7日齡時,IUGR仔豬空腸后段和結(jié)腸hsp70 mRNA的表達(dá)比NBW仔豬分別提高了13.2％(P<0.05)和20.3％(P<0.05).同樣,與NBW仔豬比較,IUGR仔豬空腸前段,回腸和結(jié)腸Hsp70蛋白表達(dá)顯著提高(P<0.05).免疫組化的結(jié)果表明,Hsp70蛋白主要位于細(xì)胞外和腸上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中,且大量在絨毛和腸腺表達(dá),而在黏膜固有層和腸肌層沒有Hsp7

6、0的陽性信號.此外,在7日齡時,IUGR仔豬空腸和回腸FoxO3a的表達(dá)比NBW仔豬分別提高了15.5％(P<0.05)和14.9％(P<0.05).
　　 2、Hsp70介導(dǎo)NF-κB免疫信號通路損傷的機(jī)理研究
　　 采用體外培養(yǎng)IEC-6細(xì)胞的方法,將試驗分成對照組、LPS組、LPS+heat組；LPS+siRNA組和LPS+siRNA+heat組.首先對LPS的作用濃度、不同熱應(yīng)激溫度和轉(zhuǎn)染時間進(jìn)行篩選,確定作為H

7、sp70基因干涉的最佳條件,然后采用western blot和流式細(xì)胞儀方法研究 Hsp70對NF-κB信號通路、FoxO3a表達(dá)以及細(xì)胞凋亡的影響.試驗結(jié)果表明:1000ng/mLLPS、41℃1h、轉(zhuǎn)染48h可作為Hsp70基因干涉的最佳條件.LPS可誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞中NF-κB的核移位(P<0.05),熱應(yīng)激可在一定程度上抑制NF-κB的核移位.將Hsp70基因干涉之后,NF-κB的核移位高于其它三組(P<0.05).相反,與對

8、照組比較,LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞中I-κBα降解,差異極顯著.熱應(yīng)激后,與LPS組相比,LPS+heat組I-κBα降解極顯著降低(P<0.01).Hsp70基因干涉組IEC-6細(xì)胞中I-κBα的降解極顯著增加.LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞后,LPS組IKKα/β活性極顯著升高.LPS誘導(dǎo)加上熱應(yīng)激后,IKKα/β的活性顯著受到抑制.將Hsp70表達(dá)抑制后,與對照組比較,IKKα/β的表達(dá)顯著升高。此外,LPS組細(xì)胞中FoxO3a的表達(dá)極

9、顯著高于對照組,將Hsp70基因干涉之后,IEC-6細(xì)胞中FoxO3a的表達(dá)極顯著降低。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,LPS可誘導(dǎo)41.8％的細(xì)胞凋亡(P<0.01).與LPS組相比,熱應(yīng)激后IEC-6細(xì)胞凋亡極顯著降低,但與對照組,IEC-6細(xì)胞凋亡仍極顯著升高.將Hsp70基因沉默后,IEC-6細(xì)胞凋亡極顯著低于其它三組(P<0.01).
　　 3、谷氨酰胺對斷奶IUGR仔豬免疫功能和Hsp70表達(dá)的影響
　　 選擇21日

10、齡,體重相近(3.5±0.5 kg)的20頭IUGR仔豬,隨機(jī)分成對照組和谷氨酰胺組(Gln組),并灌喂1 g/kg體重的谷氨酰胺或等氮的丙氨酸.斷奶后14 d,屠宰取樣,分別采用ELISA、RT-PCR和Western blot方法檢測仔豬細(xì)胞因子、hsp70mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,Gln組斷奶仔豬的平均日增重提高了27.1％(P<0.05),料重比降低了15.2％(P<0.05).與對照組相比,Gln能顯著提高空腸絨毛高度和

11、絨毛高度與隱窩深度比值(P<0.05)。此外,Gln能顯著降低血液和腸道中炎性細(xì)胞因子IL-1和IL-8的水平,提高IL-4的含量。Gln組十二指腸和空腸中hsp70mRNA的表達(dá)比對照組分別提高了16.1％(P<0.05)和8.4％(P>0.05),Hsp70蛋白比對照組分別提高了12.4％(P<0.05)和11.6％(P<0.05).
　　 綜合試驗結(jié)果表明:
　　 (1)IUGR可導(dǎo)致仔豬體重和器官重量減輕,損傷腸

12、道結(jié)構(gòu)形態(tài),并損害仔豬免疫細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌功能,導(dǎo)致仔豬早期免疫缺陷.
　　 (2)IUGR可誘導(dǎo)新生仔豬腸道黏膜Hsp70基因和蛋白的表達(dá).過表達(dá)的Hsp70可能損傷NF-κB信號通路,從而降低腸道免疫細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的功能；此外,過表達(dá)的Hsp70可能促進(jìn)FoxO3a表達(dá),而高水平的FoxO3a可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞凋亡,從而損傷腸道黏膜免疫功能和腸道消化吸收功能.
　　 (3)IEC-6細(xì)胞中Hsp70基

13、因沉默可提高IKK活性,促進(jìn)I-κBα的降解,增加NF-κB的核移位,同時抑制FoxO3a的表達(dá),從而減少IEC-6細(xì)胞凋亡.相反,過表達(dá)的Hsp70可抑制IKK活性,減少I-κBα的降解,阻礙NF-κB的核移位,并提高FoxO3a的表達(dá),從而增加IEC-6細(xì)胞凋亡.
　　 (4)Gln能提高斷奶仔豬生產(chǎn)性能,改善仔豬腸道黏膜形態(tài)功能,抑制促炎性細(xì)胞因子而提高抑炎性細(xì)胞因子的表達(dá),同時,誘導(dǎo)腸道Hsp70表達(dá)而保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受