中國東北地區(qū)玉米紋枯病菌融合群鑒定及遺傳多樣性研究.pdf

1、隨著緊湊型玉米品種的大面積種植，玉米栽培密度提高，氮肥用量增加，形成有利于玉米紋枯病發(fā)生的小氣候條件。玉米紋枯病已成為我國玉米主產區(qū)的一種重要病害，其危害日趨嚴重。東北地區(qū)是我國春玉米主產區(qū)，玉米紋枯病對該地區(qū)玉米的危害呈逐年加重的趨勢，本研究對該地區(qū)玉米紋枯病菌的融合群類群進行了系統(tǒng)鑒定并對其優(yōu)勢致病群AG1-IA進行了遺傳多樣性分析，主要研究結果如下：
　　 1.自中國東北三省采集玉米紋枯病標本300余份，分離獲得286個絲

2、核菌菌株。融合群測定結果表明，這些菌株分別屬于多核絲核菌的AG1-IA、AG1-IB、AG1-IC、AG4-HG-I、AG4-HG-III、AG-5、WAG-Z群及雙核絲核菌的AG-Ba群。其中AG1-IA是優(yōu)勢致病群，占分離菌株總數(shù)的38.46％，其次是WAG-Z和AG-5群，分別占26.92％及24.83％。AG4-HG-III群菌株是國內首次從罹病玉米植株上分離得到。
　　 2.利用5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析方法

3、，對該地區(qū)玉米紋枯病菌不同融合群代表菌株的系統(tǒng)演化關系進行了研究。結果表明，相同融合群（或亞群）的菌株，序列一致率達98-100％，而不同融合群（或亞群）菌株之間序列的一致率僅為72％-89％。說明此基因序列可以對絲核菌不同融合群或亞群的菌株進行有效區(qū)分和鑒定。依據(jù)本研究測得的31個代表菌株及10個源自GenBank且隸屬不同融合群的菌株所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,41個菌株可被劃分為3個大的分支，其中屬于立枯絲核菌（Rhizocson

4、ia solani）的6個不同融合亞群（AG4-HG-III、AG4-HG-I、AG-5、AG1-IC、AG1-IB和AG1-IA）的29個菌株構成第一個分支；第二個分支由屬于雙核絲核菌AG-Ba群的5個菌株構成；屬于多核絲核菌WAG-Z群的YR-13、YR-18和YR-69等7個菌株構成第三個分支。進一步分析三個分支間的親緣關系發(fā)現(xiàn)，屬于雙核絲核菌AG-Ba群的菌株與屬于立枯絲核菌不同融合群菌株間的親緣關系更近，而屬于WAG-Z群的不

5、同菌株與隸屬立枯絲核菌及雙核絲核菌不同融合群菌株間親緣關系相對較遠。
　　 3.利用正交試驗設計方法來優(yōu)化立枯絲核菌AG1-IA群菌株的ISSR反應體系。利用引物UBC809對體系中Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物的濃度等4個因素采用L9(34)正交表對ISSR反應體系進行了優(yōu)化。確定了ISSR擴增的優(yōu)化體系為：25μL的PCR體系中含有Mg2+2.2 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、T

6、aq DNA聚合酶0.5 U、引物0.32μmol·L-1、DNA模板0.5μL。
　　 4.利用ISSR-PCR技術對采自吉林、遼寧、山東和江蘇等不同地域的中國玉米主產省份的28個AG1-IA群菌株的遺傳多樣性進行了分析。從35個供試引物中篩選出11個多態(tài)性明顯、條帶清晰、反應穩(wěn)定的引物，進行ISSR-PCR擴增，共擴增出97條譜帶，其中特征性條帶（多態(tài)性位點）為74條，占總條帶數(shù)的76.3％。依據(jù)擴增結果，利用UPGMA法，

7、構建了其樹狀聚類圖譜。聚類分析結果表明，供試的28個菌株的遺傳相似系數(shù)在0.70～0.90，在0.73水平上,28個菌株可分為4個ISSR組（IG）。IG1是來自江蘇的1個菌株。IG2包括來自吉林、遼寧的5個菌株。IG3包括遼寧的1個菌株和江蘇的1個菌株。IG4包括剩余的20個菌株，在0.77水平上，此組又可以進一步分為4個亞組，其中第一個亞組包括10個菌株，其中有來自吉林、遼寧省的7個和來自山東的3個菌株；第二個亞組包括來自山東的3個

8、菌株；第三個亞組包括遼寧的1個菌株和山東的1個菌株；第四個亞組是來自江蘇省的5個菌株。上述結果表明，來自不同地域的AG1-IA群菌株既存在一定程度的遺傳分化現(xiàn)象也存在較大程度的相似性，來自吉林和遼寧的菌株其遺傳相似度更高，來自東北地區(qū)的菌株與山東的菌株也存在較高的相似度，而與來自江蘇的菌株間的相似度明顯降低。說明AG1-IA融合群菌株的遺傳分化與大范圍的地理位置差異存在較密切的相關性。
　　 5.利用ISSR-PCR方法對28個

9、致病力存在差異的AG1-IA群菌株的遺傳分化現(xiàn)狀進行了測定。從35個供試引物中篩選出11個多態(tài)性明顯、條帶清晰、反應穩(wěn)定的引物，進行ISSR-PCR擴增，共擴增出79條譜帶，其中特征性條帶（多態(tài)性位點）為55條，占總條帶數(shù)的69.62％。依據(jù)擴增結果，利用UPGMA法，構建了其樹狀聚類圖譜。聚類結果表明，供試的28個菌株的遺傳相似系數(shù)在0.72～0.95，在0.75水平上,28個菌株可分為3個ISSR組：IG1組包括7個強致病力的菌株；