中國北方棉區(qū)棉花立枯病菌融合群鑒定及優(yōu)勢融合群的特異性檢測.pdf

1、棉花立枯病是棉花苗期重要的土傳真菌病害之一，該病害在棉花苗期發(fā)生普遍，尤其是重茬棉田，發(fā)病率高達(dá)50％～60％，直接影響棉花的密植勻株，間接誘發(fā)中后期病害及鈴病的發(fā)生，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。我國是世界上的產(chǎn)棉大國，2004～2008年間棉花均產(chǎn)量達(dá)678.14萬噸，占世界原棉年均總產(chǎn)量的27.91％，如何有效的防治棉花立枯病害具有重要意義。
　　 以山東、河北和河南為代表的北方棉區(qū)是我國棉花主產(chǎn)區(qū)之一，常年種植面積和總產(chǎn)量均

2、占全國的25％以上，棉花立枯病對該地區(qū)棉花的危害比較嚴(yán)重，本研究對該地區(qū)棉花立枯病菌的融合群類群進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定并對其優(yōu)勢融合類群AG4-HG-Ⅰ進(jìn)行了特異性檢測，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.從山東、河北和河南三省采集棉花立枯病標(biāo)本和土壤各100余份，使用帶菌土壤溫室中種植棉苗誘發(fā)病菌，從誘導(dǎo)發(fā)病的植株上再分離病菌，以此作為對一些田間標(biāo)本采集量不足的補充。對采集到的棉花立枯病病株采用常規(guī)組織分離方法進(jìn)行分離，獲得198個絲核菌分

3、離物。融合群測定結(jié)果表明，這些菌株分別屬于多核絲核菌的AG4-HG-Ⅰ、AG4-HG-Ⅲ融合群以及雙核絲核菌的AG-A、AG-F、AG-Fb融合群。其中AG4-HG-Ⅰ是優(yōu)勢融合類群，占分離菌株總數(shù)的88.38％，其次是AG4-HG-Ⅲ群，占10.10％，AG-A、AG-F、AG-Fb各僅有1株。雙核絲核菌AG-A、AG-F和AG-Fb融合群是國內(nèi)首次從棉花植株上分離獲得。
　　 2.菌株的核相觀察顯示：雙核類的絲核菌細(xì)胞核均為

4、2個；多核類的在3個以上。AG4-HG-Ⅰ和AG4-HG-Ⅲ雖然都屬于多核類的AG-4融合群，但是兩個不同亞群的細(xì)胞核數(shù)目存在較大差異：AG4-HG-Ⅰ亞群菌株細(xì)胞核數(shù)目在6～10個之間，AG4-HG-Ⅲ亞群菌株細(xì)胞核數(shù)目在3～5個之間。
　　 3.利用5.8SrDNA-ITS區(qū)序列分析方法，對該地區(qū)棉花立枯病菌不同融合群代表菌株的系統(tǒng)演化關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，相同融合群(或亞群)的菌株，序列一致率達(dá)98～100％，而不同融

5、合群(或亞群)菌株之間差異較大。說明此基因序列可以對絲核菌不同融合群或亞群的菌株進(jìn)行有效區(qū)分和鑒定。依據(jù)本研究測得的16個代表菌株及13個源自GenBank且隸屬不同融合群的菌株序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，所有供試菌株被分成三個大組。第一組為多核類絲核菌，包括AG-4融合群的兩個亞群即AG4-HG-Ⅰ和AG4-HG-Ⅲ，這兩個亞群在進(jìn)化上關(guān)系較近；第二組為兩個雙核類絲核菌群，為AG-F和AG-Fb兩個融合群；第三組為雙核類的AG-A

6、融合群。進(jìn)一步分析各融合群間的進(jìn)化關(guān)系可以看出，雙核類的AG-F和AG-Fb兩個融合亞群與多核類的AG-4融合群親緣關(guān)系相近，而同屬于雙核絲核菌的AG-A與AG-4融合群的進(jìn)化關(guān)系相對較遠(yuǎn)。
　　 4.采用麥粒-土壤接種法對棉花立枯病菌的優(yōu)勢融合類群AG4-HG-Ⅰ菌株以及分離得到的雙核絲核菌進(jìn)行致病性測定。結(jié)果表明，所有的AG4-HG-Ⅰ群菌株均有較強的致病性，平均病情指數(shù)為55～100,三個雙核絲核菌對棉花幼苗的平均病情指數(shù)

7、為12.77。
　　 5.用三個雙核絲核菌針對棉花立枯病優(yōu)勢致病群AG4-HG-Ⅰ進(jìn)行生防效果測定，用DPS軟件對病情指數(shù)進(jìn)行studentt值檢驗。結(jié)果表明：三個雙核絲核菌菌株對棉花立枯絲核菌AG4-HG-Ⅰ融合群菌株的生防效果不明顯。
　　 6.利用35個ISSR引物對來自不同寄主上的AG4-HG-Ⅰ融合群菌株(8個)，以及12個其他融合群菌株進(jìn)行ISSR分析。從中選取出8個能對AG4-HG-Ⅰ群菌株擴(kuò)增出特異性條帶

8、的引物，利用這些引物對各融合群代表性菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，將僅對AG4-HG-Ⅰ融合群特異的片段進(jìn)行膠回收、測序，并根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計出針對AG4-HG-Ⅰ的特異性引物對。
　　 7.用所合成的引物進(jìn)行特異性檢測結(jié)果表明，引物對J6-S和J6-A能針對AG4-HG-Ⅰ群菌株擴(kuò)增出特異性片段，所擴(kuò)增的片段大小為363bp，屬于其他融合群的絲核菌菌株沒有擴(kuò)增到任何片段；利用設(shè)計的引物分別檢測用AG4-HG-Ⅰ融合群菌株接種的土