柑桔黃龍病菌特異性基因片段克隆及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究.pdf

1、柑桔黃龍?。℉LB）由韌皮部難養(yǎng)菌引起，是嚴(yán)重影響全世界柑桔生產(chǎn)的重大檢疫性病害之一。柑桔發(fā)病后輕者影響產(chǎn)量和品質(zhì)，重者造成柑桔樹(shù)的枯死。目前除嚴(yán)格防治木虱和挖除病樹(shù)外，國(guó)內(nèi)外對(duì)柑桔黃龍病尚無(wú)很好的根除方法，唯有通過(guò)設(shè)立和建設(shè)無(wú)病區(qū)、加強(qiáng)植物檢疫嚴(yán)防病害傳入。因此，加強(qiáng)病害的早期診斷和檢測(cè)技術(shù)的研究尤為重要。柑桔黃龍病菌的傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)都存在一定的局限性，如特異性差、靈敏度低，尤為關(guān)鍵的是不能對(duì)病害進(jìn)行早期快速準(zhǔn)確檢測(cè)。而核酸水平的分子檢

2、測(cè)技術(shù)具有快速、特異、靈敏的特點(diǎn)，可以滿足國(guó)內(nèi)外現(xiàn)代植物檢疫的要求。 研究目的：本文對(duì)柑桔黃龍病菌核酸分子檢測(cè)技術(shù)和生物大分子常溫貯藏技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，旨在建立起快速準(zhǔn)確穩(wěn)定安全的柑桔黃龍病菌分子檢測(cè)技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)柑桔樣品的快速檢驗(yàn)，為柑桔非疫區(qū)生產(chǎn)建設(shè)和病害預(yù)警監(jiān)測(cè)提供一種分子檢測(cè)技術(shù)和實(shí)用工具。 研究方法：利用CTAB法，試劑盒法和浸泡過(guò)濾法提取柑桔黃龍病菌的核酸DNA；利用引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer Pre

3、mier 5.0 進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)；PCR同步擴(kuò)增柑桔葉面腐生菌，柑桔潰瘍病菌和衰退病菌等等植物細(xì)菌和病原物來(lái)驗(yàn)證檢測(cè)的特異性；PCR擴(kuò)增含有靶片段的質(zhì)粒DNA測(cè)定檢測(cè)的靈敏度；通過(guò)在不同DNA擴(kuò)增儀和溫度控制方式下的擴(kuò)增程序優(yōu)化測(cè)定檢測(cè)的穩(wěn)定性。將靶片段與克隆載體pMD-18T連接后，用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E. Coli，JM109），然后通過(guò)測(cè)序來(lái)驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性；以重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化的大腸桿菌構(gòu)建了無(wú)害化陽(yáng)性參照體

4、系。采用預(yù)混PCR反應(yīng)液中加入生物活性分子穩(wěn)定劑并冷凍干燥固相化處理的方法研制出能常溫貯存的方便有效的檢測(cè)試劑盒。利用優(yōu)化的分子檢測(cè)體系對(duì)江西、浙江、廣西、湖南、重慶和四川等地采集的柑桔樣品進(jìn)行了PCR實(shí)際檢測(cè)。利用iCycler iQ定量PCR儀對(duì)柑桔黃龍病的定量檢測(cè)做了初步的研究。 研究結(jié)果： 1)通過(guò)比較研究不同制樣方法對(duì)檢測(cè)效果的影響，確定浸泡過(guò)濾法能有效地排除植物色素、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)對(duì)PCR反應(yīng)的干擾，制備

5、適合于PCR反應(yīng)的靶細(xì)菌DNA，避免PCR反應(yīng)的假陰性發(fā)生。 2)根據(jù)柑桔黃龍病菌核糖體蛋白基因設(shè)計(jì)篩選了不同的引物對(duì)，篩選出特異性強(qiáng)穩(wěn)定性好靈敏度高的引物對(duì)CQULAF3/CQULAR3，并由此建立了準(zhǔn)確、快速、靈敏、穩(wěn)定、安全的柑桔黃龍病菌PCR檢測(cè)體系。 3)在引物CQULAF3/CQULAR3擴(kuò)增產(chǎn)物中設(shè)計(jì)了引物CQULAF4/CQULAR4，和TaqMan探針。利用熒光定量PCR對(duì)柑桔黃龍病無(wú)癥樣品進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)

6、，與經(jīng)典PCR相比更靈敏、更簡(jiǎn)便、更快速，但檢測(cè)成本高。 4)柑桔黃龍病菌是柑桔韌皮部難培養(yǎng)菌，利用浸泡過(guò)濾方法提取的總DNA由于含量不同而且保存期限短，不宜作為陽(yáng)性對(duì)照。而以轉(zhuǎn)化的病菌靶序列重組質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，不僅檢測(cè)穩(wěn)定效果理想，而且安全可靠，可以用作定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。 5)預(yù)混PCR反應(yīng)液中加入適量的生物活性分子穩(wěn)定劑（MS），對(duì)DNA聚合酶，dNTPs等生物大分子具有良好的常溫穩(wěn)定作用，含有MS的預(yù)混PCR