柑桔黃龍病菌特異性基因片段克隆及檢驗檢疫技術(shù)研究.pdf

1、柑桔黃龍病（HLB）由韌皮部難養(yǎng)菌引起，是嚴(yán)重影響全世界柑桔生產(chǎn)的重大檢疫性病害之一。柑桔發(fā)病后輕者影響產(chǎn)量和品質(zhì)，重者造成柑桔樹的枯死。目前除嚴(yán)格防治木虱和挖除病樹外，國內(nèi)外對柑桔黃龍病尚無很好的根除方法，唯有通過設(shè)立和建設(shè)無病區(qū)、加強(qiáng)植物檢疫嚴(yán)防病害傳入。因此，加強(qiáng)病害的早期診斷和檢測技術(shù)的研究尤為重要。柑桔黃龍病菌的傳統(tǒng)檢測技術(shù)都存在一定的局限性，如特異性差、靈敏度低，尤為關(guān)鍵的是不能對病害進(jìn)行早期快速準(zhǔn)確檢測。而核酸水平的分子檢

2、測技術(shù)具有快速、特異、靈敏的特點，可以滿足國內(nèi)外現(xiàn)代植物檢疫的要求。 研究目的：本文對柑桔黃龍病菌核酸分子檢測技術(shù)和生物大分子常溫貯藏技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，旨在建立起快速準(zhǔn)確穩(wěn)定安全的柑桔黃龍病菌分子檢測技術(shù)體系，實現(xiàn)柑桔樣品的快速檢驗，為柑桔非疫區(qū)生產(chǎn)建設(shè)和病害預(yù)警監(jiān)測提供一種分子檢測技術(shù)和實用工具。 研究方法：利用CTAB法，試劑盒法和浸泡過濾法提取柑桔黃龍病菌的核酸DNA；利用引物和探針設(shè)計軟件Primer Pre

3、mier 5.0 進(jìn)行引物和探針的設(shè)計；PCR同步擴(kuò)增柑桔葉面腐生菌，柑桔潰瘍病菌和衰退病菌等等植物細(xì)菌和病原物來驗證檢測的特異性；PCR擴(kuò)增含有靶片段的質(zhì)粒DNA測定檢測的靈敏度；通過在不同DNA擴(kuò)增儀和溫度控制方式下的擴(kuò)增程序優(yōu)化測定檢測的穩(wěn)定性。將靶片段與克隆載體pMD-18T連接后，用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E. Coli，JM109），然后通過測序來驗證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性；以重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化的大腸桿菌構(gòu)建了無害化陽性參照體

4、系。采用預(yù)混PCR反應(yīng)液中加入生物活性分子穩(wěn)定劑并冷凍干燥固相化處理的方法研制出能常溫貯存的方便有效的檢測試劑盒。利用優(yōu)化的分子檢測體系對江西、浙江、廣西、湖南、重慶和四川等地采集的柑桔樣品進(jìn)行了PCR實際檢測。利用iCycler iQ定量PCR儀對柑桔黃龍病的定量檢測做了初步的研究。 研究結(jié)果： 1)通過比較研究不同制樣方法對檢測效果的影響，確定浸泡過濾法能有效地排除植物色素、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)對PCR反應(yīng)的干擾，制備

5、適合于PCR反應(yīng)的靶細(xì)菌DNA，避免PCR反應(yīng)的假陰性發(fā)生。 2)根據(jù)柑桔黃龍病菌核糖體蛋白基因設(shè)計篩選了不同的引物對，篩選出特異性強(qiáng)穩(wěn)定性好靈敏度高的引物對CQULAF3/CQULAR3，并由此建立了準(zhǔn)確、快速、靈敏、穩(wěn)定、安全的柑桔黃龍病菌PCR檢測體系。 3)在引物CQULAF3/CQULAR3擴(kuò)增產(chǎn)物中設(shè)計了引物CQULAF4/CQULAR4，和TaqMan探針。利用熒光定量PCR對柑桔黃龍病無癥樣品進(jìn)行動態(tài)檢測

6、，與經(jīng)典PCR相比更靈敏、更簡便、更快速，但檢測成本高。 4)柑桔黃龍病菌是柑桔韌皮部難培養(yǎng)菌，利用浸泡過濾方法提取的總DNA由于含量不同而且保存期限短，不宜作為陽性對照。而以轉(zhuǎn)化的病菌靶序列重組質(zhì)粒DNA作為陽性對照，不僅檢測穩(wěn)定效果理想，而且安全可靠，可以用作定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)。 5)預(yù)混PCR反應(yīng)液中加入適量的生物活性分子穩(wěn)定劑（MS），對DNA聚合酶，dNTPs等生物大分子具有良好的常溫穩(wěn)定作用，含有MS的預(yù)混PCR