抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的構(gòu)建，表達(dá)及特異性研究.pdf

1、目的：構(gòu)建含抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體（TfR-scFv）和EGFP 融合蛋白基因的重組真核表達(dá)載體pTfRscfv-EGFP。并轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，鑒定融合蛋白的生物學(xué)活性。為單鏈抗體-熒光融合蛋白在腫瘤示蹤、定位、顯像等方面的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：以Chi7579-p γ-Expr和Chi7579-p κ-Expr 載體為模板，設(shè)計兩對引物引入中間連接肽(Gly4Ser)3 以及酶切位點Hind Ⅲ和BamH

2、Ⅰ，采用重疊延伸PCR的方法，分別擴(kuò)增抗TfR單鏈抗體的輕、重鏈可變區(qū)(VL、VH)基因，二基因之間以連接肽(Gly4Ser)3的編碼序列連接，從而構(gòu)建具有前導(dǎo)肽的L-VH-Linker-VL單鏈抗體基因。將獲得的單鏈抗體基因克隆至pGEM-T 載體(scFv-T)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑取陽性克隆擴(kuò)增。提取質(zhì)粒以Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定，并測序證實正確后，亞克隆至pEGFP-N1，獲得pTfRscfv-EG

3、FP，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，倒置相差熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，熒光分光光度計檢測細(xì)胞分泌上清熒光強(qiáng)度，并通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞分泌上清與乳腺癌細(xì)胞MCF-7 及黑色素瘤細(xì)胞A375的結(jié)合活性。
　　 結(jié)果：測序結(jié)果表明獲得了正確的L-VH-Linker-VL單鏈抗體基因序列；亞克隆至pEGFP-N1后，Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切可見約800bp的小片段和約4.5Kb的大片段，與理論計算值相符，表明pTfRs

4、cfv-EGFP 真核表達(dá)載體構(gòu)建成功；表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，24 小時后，可見熒光在細(xì)胞中呈指環(huán)狀分布，細(xì)胞核無表達(dá)，為典型的分泌性表達(dá)模式，而pEGFP-N1 空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，熒光則呈彌漫性分布，以核中分布較多。收集轉(zhuǎn)染后72h的細(xì)胞培養(yǎng)上清，用F4500熒光分光光度計檢測其熒光強(qiáng)度，實驗組細(xì)胞上清的熒光強(qiáng)度較對照組高出約兩倍以上，證實抗TfR-scFv-EGFP 融合蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分泌性表達(dá)；FCM檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上

5、清與A375細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞的結(jié)合，結(jié)果表明抗TfR-scFv-EGFP 融合蛋白能夠與上述天然高表達(dá)TfR的細(xì)胞特異性的結(jié)合，對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清則未見與上述細(xì)胞有結(jié)合。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建抗TfR-scFv-EGFP 融合蛋白的真核表達(dá)載體pTfRscfv-EGFP，融合蛋白可在COS-7細(xì)胞中分泌性表達(dá)，且具有與TfR 陽性細(xì)胞結(jié)合的活性并發(fā)綠色熒光，本實驗為進(jìn)一步將該融合蛋白作為腫瘤示蹤、定位、顯像的特異性分子奠定了