雞Toll受體的初步研究.pdf

1、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類新的天然免疫受體，它能夠特異性地識(shí)別侵入的病原微生物，通過(guò)偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活天然免疫細(xì)胞，最終引起一系列的炎癥反應(yīng)。TLRs不僅能激活天然免疫系統(tǒng)，而且也為激活獲得性免疫提供共刺激信號(hào)。目前已經(jīng)確認(rèn)發(fā)現(xiàn)了13種TLRs，在機(jī)體中分布廣泛，大約20余種細(xì)胞表面均有表達(dá)?，F(xiàn)在已經(jīng)在雞的多種組織、分離的免疫細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞中確定了9種雞的TLRs(ChTLR

2、s)。本研究旨在以IBDV感染模型，探索在IBDV疫苗免疫過(guò)程中chTLRs參與免疫反應(yīng)的機(jī)制，尋找在該病毒感染中介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的主要TLRs。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)外源物質(zhì)調(diào)節(jié)該chTLRs，應(yīng)用于IBDV疫苗中，希望能夠增強(qiáng)疫苗的免疫效果。本研究主要內(nèi)容包括：
　　 ⑴海蘭褐蛋雞體內(nèi)Toll受體類型的研究。在本研究中，根據(jù)已報(bào)道出來(lái)的雞的9種Toll樣受體(TLR)的11個(gè)基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，從海蘭褐蛋蛋雞體內(nèi)擴(kuò)增出11個(gè)雞T

3、oll樣受體部分基因片段，與GenBank已發(fā)表序列比對(duì)，同源率達(dá)100％。同時(shí)根據(jù)人TLR9、鼠TLR9、豬TLR9基因序列設(shè)計(jì)引物，從雞總cDNA中擴(kuò)增雞TLR9，最后結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞體內(nèi)不存在TLR9。
　　 ⑵chTLR3、chTLR7和chTLR21熒光PCR檢測(cè)方法的建立。本試驗(yàn)旨在建立檢測(cè)chTLR3、chTLR7、chTLR21 mRNA的熒光定量檢測(cè)方法。以上一章構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMD19-T-pchTLR3、 pM

4、D19-T-pchTLR7、pMD19-T-pchTLR21為標(biāo)準(zhǔn)模板，設(shè)計(jì)合成3對(duì)特異的引物，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了檢測(cè)chTLR3、chTLR7、chTLR21 mRNA的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。所建標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)均符合要求，chTLR3和chTLR7敏感度檢測(cè)為100拷貝/ul，β-actin和chTLR21為10拷貝/ul，各曲線具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　 ⑶IBDV中強(qiáng)毒株感染雞后chTLR

5、3、chTLR7和chTLR21 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)IBDV中強(qiáng)毒株感染雞后，檢測(cè)雞法氏囊和脾臟內(nèi)TLR3 mRNA、TLR7mRNA、TLR21mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，分析這些受體在病毒早期感染中的作用。將40只14日海蘭褐蛋雞隨機(jī)分成兩組:對(duì)照組10只雞;實(shí)驗(yàn)組30只雞。實(shí)驗(yàn)組接種IBDV活疫苗（CEVAC(@)IBD L，W2512株）2羽份/只，對(duì)照組注射生理鹽水，隔離飼養(yǎng)。在免疫前和免疫后12h、24h、48h、72

6、h、130h各時(shí)間點(diǎn)每組分別斷頸處死5只雞，取脾臟和法氏囊分離淋巴細(xì)胞并提取總RNA。用建立的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法檢測(cè)各組中chTLR3、chTLR7、chTLR21表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，在免疫后36小時(shí)，雞法氏囊和脾臟中chTLR3表達(dá)變化最顯著，在免疫后48小時(shí)，雞脾臟和法師囊中TLR21表達(dá)變化也較為明顯，但是沒(méi)有chTLR3變化顯著，在整個(gè)免疫時(shí)間段內(nèi)，兩種組織中chTLR7表達(dá)變化不顯著。
　　 ⑷體外poly(l

7、):C和CpG對(duì)chTLR3 mRNA表達(dá)的影響。通過(guò)體外試驗(yàn)評(píng)價(jià)poly(I):C和CpG對(duì)chTLR3mRNA表達(dá)的影響。無(wú)菌提取雞外周血淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml，以6ml/孔鋪于6孔細(xì)胞板。將poly(I):C和CpG添加到細(xì)胞培養(yǎng)液，使其終濃度分別為100ug/ml和50ug/ml，各濃度設(shè)置2個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，置于37℃5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。并在佐劑添加前和添加后3h、6h、9h、12h、24h

8、收集淋巴細(xì)胞，提取淋巴細(xì)胞中的總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。以第二章試驗(yàn)所建的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法檢測(cè)各組細(xì)chTLR3mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，poly(I):C組在培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)時(shí)chTLR3 mRNA表達(dá)量最高，CpG組chTLR3 mRNA表達(dá)量在添加CpG后表達(dá)量受抑制，此結(jié)果說(shuō)明polyI:C是chTLR3特異性配體，并且能夠刺激chTLR3 mRNA表達(dá)。
　　 ⑸Polyl:C對(duì)IBDV活疫苗的免疫影響。將30只

9、14日齡海蘭褐蛋雞分成三組:對(duì)照組、IBDV疫苗組、polyI:C+IBDV疫苗組，每組10只，各組隔離飼養(yǎng)。自免疫之日起，每周采血一次，共采血5次，并分離血清。用IBDV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體效價(jià)。免疫5周后，用IBDV BC6/85株進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為100 BID50/羽份，攻毒后每天觀察雞只狀態(tài)乖死亡情況，第4天全部處死，解剖觀察病變。結(jié)果顯示，添加佐劑組的抗體與疫苗免疫對(duì)照組抗體水平相當(dāng)，攻毒保護(hù)率高10％，但差異不顯著(P