豬鏈球菌2型檢測方法的研究及其在出入境檢疫中的應(yīng)用.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種重要的人畜共患病病原菌，能引起豬的敗血癥、腦膜炎、肺炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性漿膜炎等;該菌在特定情況下也能感染人，引起人的急性敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎等疾病。豬鏈球菌病呈世界性分布。目前，美國、荷蘭、英國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、比利時、巴西、丹麥、挪威、芬蘭、西班牙、德國、愛爾蘭、中國、日本等幾乎所有養(yǎng)豬國家和地區(qū)均有發(fā)生豬鏈球菌病的報道，這不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失

2、，同時還對公共衛(wèi)生尤其是相關(guān)從業(yè)人員的健康構(gòu)成嚴重威脅。在中國，SS2最早于90年代初發(fā)生于廣東，但未見感染人的報道;1998～1999年江蘇省部分地區(qū)豬群爆發(fā)該病,同時造成25人感染發(fā)病，其中14人死亡;尤其是2005年夏季在四川豬群爆發(fā)該病，造成214人感染發(fā)病，其中39人死亡.此外，重慶、香港、江西、廣東等地也有人感染豬鏈球菌的零星病例發(fā)生.因此，加強豬鏈球菌檢測技術(shù)的研究，開展豬鏈球菌的檢測，防止豬鏈球菌2型傳入傳出，為進出口貿(mào)

3、易提供技術(shù)保障，具有重要的意義。
　　 1.豬源動物產(chǎn)品中豬鏈球菌2型檢測方法的建立建立了豬源動物產(chǎn)品中豬鏈球菌2型的選擇性增菌和選擇性平板分離方法.樣品與Todd-Hewitt肉湯(THB)按1∶10的比例均質(zhì)后，加入終濃度分別為0.2 g/L疊氮鈉、0.0002 g/L結(jié)晶紫和0.1 g/L亞硫酸鈉，于37℃靜置培養(yǎng)18h后，在含有0.2 g/L疊氮鈉、0.0002 g/L結(jié)晶紫和0.1g/L亞硫酸鈉的5％脫纖維羊血哥倫比亞

4、瓊脂的選擇性平板上進行平板分離。與非選擇性增菌液和分離平板相比，豬鏈球菌典型菌落顯著增加，雜菌顯著減少，分離更加容易，分離率顯著提高。
　　 2.豬鏈球菌2型分型血清的制備將豬鏈球菌2型(SS2)參考菌株ATCC43765在Todd-Hewitt肉湯中連續(xù)傳代三代，每次培養(yǎng)6小時，然后按照1∶10的比例接種于Todd-Hewitt肉湯僅培養(yǎng)2小時，經(jīng)滅活處理后獲得含較多英膜物質(zhì)的全菌菌體抗原。該抗原按照每周三次，除第一周按2.0

5、(×)109 cfu/次，其余按8.0×109 cfu/次靜脈免疫家兔制備全菌抗血清。經(jīng)測定，該血清僅與SS2發(fā)生凝集反應(yīng)，凝集價為128，不與其它鏈球菌發(fā)生凝集反應(yīng)，表明該血清具有較高的特異性，可作為SS2的分型血清。在全國檢驗檢疫系統(tǒng)廣泛應(yīng)用，僅在江蘇口岸對125株疑似菌株進行鑒定，共鑒定出17株豬鏈球菌2型菌株。
　　 3.豬鏈球菌2型溶血素基因的檢測根據(jù)GenBank發(fā)表的豬鏈球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列

6、，利用oligo(7.0)軟件設(shè)計和合成了可擴增長度為495bp的引物，建立了的SS2溶血素基因的PCR檢測方法。應(yīng)用該方法可從SS2參考菌株ATCC43765、SS2江蘇分離株HA9801中擴增出495bp的條帶，利用HindⅢ限制性內(nèi)切酶對具有相應(yīng)單一酶切位點的PCR擴增產(chǎn)物就進行酶切，獲得預(yù)期的314bp和181bp的2個DNA片段，檢測靈敏度達到2.5 x102cfu/mL;但不能從馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246、大腸埃希菌

7、ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、單增李斯特桿菌ATCC19115/413、糞腸球菌ATCC29212中擴增出相應(yīng)條帶。PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果與GenBank的豬鏈球菌sly基因(Z36907)核苷酸序列完全一致。表明本方法可快速、敏感、特異地檢測SS2的溶血素基因。對江蘇口岸分離的125株疑似豬鏈球菌菌株進行溶血素基因檢測，其中27株豬鏈球菌均檢出了豬鏈球菌溶血素基因，陽性率為100％,其它菌株均未檢出豬鏈球菌溶

8、血素基因。
　　 4.江蘇出入境豬源動物產(chǎn)品中豬鏈球菌的檢測2005年～2010年，對江蘇出入境豬源動物產(chǎn)品中進行了豬鏈球菌檢測，通過選擇性增菌和平板分離，從920份樣品中分離到125鏈球菌菌株。通過生化鑒定、血清學(xué)鑒定和分子鑒定，共檢出27株豬鏈球菌，陽性率為2.93％(27/920)，其中豬鏈球菌2型為17株，陽性率為1.85％(17/920)。結(jié)果表明，江蘇出口養(yǎng)殖場及進出境豬副產(chǎn)品中有豬鏈球菌存在，但流行率不很高。上述工