生防多粘芽孢桿菌SQR-21的定殖與誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性研究.pdf

1、近年來，隨著化學(xué)農(nóng)藥大量使用造成的環(huán)境污染，農(nóng)藥殘留問題的凸現(xiàn)，人們把目光投向了生物防治，生防菌劑、微生物有機(jī)肥等生防產(chǎn)品得到了廣泛的使用并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。多粘芽孢桿菌由于能分泌多種抗菌素，是生防菌家族中的重要成員之一。本文研究了生防多粘芽孢桿菌SQR-21在根際的定殖、誘導(dǎo)植物獲得系統(tǒng)抗性及其它生防機(jī)制，為其在生物防治領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 從一株野生型芽孢桿菌中分離獲得了質(zhì)粒pPZZ84，首先根據(jù)rep基因的

2、保守序列，先擴(kuò)得rep基因片段并測序，然后根據(jù)質(zhì)粒的環(huán)狀特征，在rep基因片段的兩側(cè)反向設(shè)計(jì)引物擴(kuò)得質(zhì)粒的剩余片段并測序，最后拼接獲得了質(zhì)粒pPZZ84的全序列(6817bp)。序列分析表明pPZZ84的大小為6817bp，G+C的含量是36.7％。ORF預(yù)測結(jié)果表明，pPZZ84含有7個(gè)ORF閱讀框，其中ORF5和ORF7分別編碼Rap(天門冬氨酸磷酸酶)和Rep蛋白，ORF1和ORF2編碼2個(gè)未知蛋白，ORF3，4和6在目前的NCB

3、I蛋白數(shù)據(jù)庫中尚未找到同源性蛋白序列。熒光定量PCR結(jié)果表明pPZZ84在宿主的拷貝數(shù)為46。
　　 為研究生防芽孢桿菌SQR-21在土壤和植物組織的定殖情況，分別以pUB110和pPZZ84的rep基因，km抗性基因和組成型啟動子PHapⅡ分別構(gòu)建了生防芽孢桿菌gfp標(biāo)記載體pHapⅡ(6838bp)和pHapⅢ(7835bp)。轉(zhuǎn)化結(jié)果表明pHapⅡ能在枯草芽孢桿菌，短小芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌及多粘芽孢桿菌的一些野生型菌株

4、中轉(zhuǎn)錄復(fù)制，而pHapⅢ只能在短小芽孢桿菌中復(fù)制、表達(dá)。質(zhì)粒穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，pHapⅡ在枯草芽孢桿菌SQR-9和短小芽孢桿菌JK-001內(nèi)有較高的穩(wěn)定性，在無抗生素壓力下連續(xù)培養(yǎng)96代后，質(zhì)粒丟失率小于10％;而在多粘芽孢桿菌SQR-21中的穩(wěn)定性較低，質(zhì)粒在無抗生素壓力下連續(xù)培養(yǎng)96代后基本完全丟失。標(biāo)記菌株SQR-21在黃瓜根際及根表的定殖研究發(fā)現(xiàn)生防菌株SQR-21/pHapⅡ能在根表定殖，接種4天后，數(shù)量達(dá)到5.85 log

5、 CFU·g-1 root，8天后數(shù)量增加到6.88 log CFU·g-1root。然后數(shù)量稍有減少，第12天至第16天，數(shù)量維持在5.9 log CFU·g-1 root。標(biāo)記菌株SQR-21/pHapⅡ在根際土壤中的數(shù)量低于根表的數(shù)量，從第4天至第16天數(shù)量約為4.5 log CFU·g-1 root。試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)標(biāo)記菌株SQR-21/pHapⅡ也能在植物根內(nèi)少量定殖約2 log CFU·g-1 root。
　　 生防菌誘導(dǎo)

6、植物系統(tǒng)抗性是其生防機(jī)制的重要組成部分。以黃瓜-炭疽病為研究對象，研究了多粘芽孢桿菌SQR-21，蕈狀芽孢桿菌BmJ和莫哈韋芽孢桿菌203-7對黃瓜的誘導(dǎo)抗性。研究表明經(jīng)生防菌SQR-21，BmJ和203-7處理的黃瓜其病變組織的產(chǎn)孢率較對照分別減少69％，42％和58％。生防菌能夠快速的誘導(dǎo)黃瓜植株中抗病相關(guān)蛋白基因PR1-1a，PR-3，APOX的表達(dá)，生防菌處理的黃瓜侵染葉片的PR1-1a在第2天都得到了高效的表達(dá)，而對照處理的黃

7、瓜侵染葉片的PR1-1a基因直到第3天才有了少量的表達(dá)。BmJ處理的黃瓜侵染葉片的PR-3在第1天就有了顯著的表達(dá)，其他處理雖然在第2天也有了一定的表達(dá)，但是和BmJ的相比差異顯著，在第2天，BmJ處理的PR-3表達(dá)量是對照處理的5倍。在病原菌侵染后第1天203-7處理的黃瓜侵染葉片的APOX表達(dá)量與其他處理差異顯著。
　　 經(jīng)生防菌誘導(dǎo)的植物病變組織的β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性得到了一定的提高。BmJ處理的黃瓜侵染葉片

8、內(nèi)幾丁質(zhì)酶活最高，相對于無菌水處理提高了96％;生防菌203-7和SQR-21處理的幾丁質(zhì)酶活較無菌水處理也分別提高了65％和72％。203-7處理的黃瓜侵染葉內(nèi)β-1，3葡聚糖酶活最高，相對于無菌水處理提高了163％;生防菌BmJ和SQR-21處理的β-1，3葡聚糖酶活較無菌水處理也分別提高了127％和118％。
　　 通過熒光定量PCR的方法研究了生防菌處理對病原菌Glomerella cingulata var.orbic

9、ulare在黃瓜病變周圍組織的定殖的影響，結(jié)果表明炭疽病病原菌侵染3天后，經(jīng)SQR-21處理的葉片病變周圍組織中炭疽病病原菌DNA濃度是對照處理三分之一，203-7處理的葉片病變周圍組織中病原菌DNA濃度為對照的二分之一，而BmJ處理的葉片病變周圍組織中炭疽病病原菌DNA濃度為對照為三分之二。從3dpi到11dpi，對照處理的葉片病變周圍組織中病原菌DNA濃度增加了28倍，而生防菌處理的只增加了21倍小。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)了SQR-21處理

10、的黃瓜其病原菌侵染后附著胞和剛毛數(shù)量的小于對照，該結(jié)果表明SQR-21處理的黃瓜能抑制病原菌孢子的萌發(fā)和孢子的形成。生防芽孢桿菌SQR-21還能誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生酚類抗毒素物質(zhì)及抑制細(xì)菌的群體感應(yīng)。
　　 以擬南芥-灰霉的植物病害體系為模式，研究了拮抗菌處理對擬南芥發(fā)病率的影響以及SQR-21誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性所依賴的激素信號途徑。結(jié)果表明，對照處理的發(fā)病率高達(dá)80％左右，SQR-21及BmJ處理次之，分別為65％和54％。經(jīng)生防菌SQ

11、R-21誘導(dǎo)的葉片其病變組織的面積較對照處理的小得多。SQR-21能夠誘導(dǎo)相關(guān)激素途徑的基因表達(dá)并減少植株的發(fā)病率，當(dāng)JA途徑缺失時(shí)，SQR-21處理的擬南芥植株誘導(dǎo)調(diào)控受到抑制，不僅影響了PDF1.2的表達(dá)，對SA途徑相關(guān)基因PR-1的表達(dá)也產(chǎn)生了一定的抑制作用。但是在JA途徑存在的情況下，SQR-21處理的擬南芥在受病原菌侵染時(shí)能夠較對照處理更快的表達(dá)PDF1.2基因，表達(dá)量也高于對照。根據(jù)以上結(jié)果推測SQR-21誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性是