利用mRNA差異顯示技術(shù)克隆球孢白僵菌在蟬蛻和蠶血淋巴誘導下的特異表達基因.pdf

1、隨著人們對環(huán)境保護認識的加深，由化學農(nóng)藥產(chǎn)生的3R問題已經(jīng)越來越受到重視。利用生物殺蟲劑控制害蟲已經(jīng)是不可逆轉(zhuǎn)的趨勢。蟲生真菌作為農(nóng)林生態(tài)系中昆蟲的重要致死因子，由于其對環(huán)境相容，不易產(chǎn)生抗藥性，以及資源豐富，開發(fā)成本較低等優(yōu)點，已經(jīng)被作為控制害蟲爆發(fā)的重要因子。但是，其應(yīng)用仍然存在諸多缺點，如藥效慢，環(huán)境適應(yīng)性差等。因此，如何提高球孢白僵菌的毒力與抗逆性始終是業(yè)內(nèi)研究的熱點。
　　 要改造和構(gòu)建高毒、速效、穩(wěn)定的新型白僵菌菌株

2、，必須了解白僵菌侵染昆蟲的機制與機理。本研究以球孢白僵菌為研究對象，通過模擬球孢白僵菌侵染昆蟲的過程，分析在侵染過程中球孢白僵菌的分子對策，試圖發(fā)現(xiàn)了一些與侵染過程相關(guān)的基因。
　　 首先，本研究對白僵菌進行液體培養(yǎng)，并加入蟬蛻和蠶血淋巴進行誘導培養(yǎng)24h，分別提取誘導菌絲的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入差異顯示引物進行PCR擴增；PAGE膠電泳后，將膠上的差異條帶割膠回收，克隆測序。通過Blast序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：9個與昆

3、蟲侵染機制相關(guān)的基因序列，27個假定蛋白基因序列，5個未知序列；其中與侵染過程相關(guān)的表達基因，包括：蛋白酶成熟因子、尿囊通透酶、膜上G蛋白、以及第二信使cAMP等編碼基因。這些基因在血淋巴和蟬蛻誘導與對照處理下，均存在差異表達。
　　 其次，本研究進一步利用real-time PCR技術(shù)對蛋白酶成熟因子的表達進行了精確驗證；結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在蟬蛻誘導條件下，與對照處理相比，該基因的表達量為上調(diào)了8倍左右。
　　 本研究通過mR