鹿重組PrPc蛋白單克隆抗體的制備及CWD免疫組織化學檢測方法的建立.pdf

1、PreparationofMonoclonalAntibodyagainstPrPcandDevelopmentofIHCforCWDResistin，t‘11hcsIssubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof—MasterofAgronomyZhangXinxin(CollegeofAnimalSciencea

2、ndVeterinaryMedicine)Supervisor：LiuHuanqiQingdaoChinaJune，2012鹿重組PrPc蛋白單克隆抗體的制備及CWD免疫組織化學檢測方法的建立摘要傳染性海綿狀腦病(TransmissiblespongiformcncephalopathyTSE)是一種重要的人畜共患病，主要的感染動物包括羊、牛、水貂及一些鹿科動物。鹿的TSE稱為鹿慢性消耗性疾病(ChronicWastingDisease

3、，CWD)。TSE的病原是一種由體內正常的朊蛋白(PrPc)轉化成的朊毒體(PrPsc)。目前檢測該病較為有效的方法是免疫組化，組織切片經(jīng)蛋白酶K消化后，PrPc被完全消化，而prpsc的核心片段能抵抗蛋白酶K消化保留了下來，由于PrPc和PrPsc的一級結構相同，制備PrPc核心片段的單抗就可以用于CWD的免疫學檢測。本試驗在已經(jīng)獲得prpc陽性重組質粒EPrPpET32a()的基礎上，將其轉化EcoliBL21(DE3)，挑取陽性克

4、隆培養(yǎng)，IPTG誘導后裂解茵體作SDSPAGE分析，出現(xiàn)大小約2730KD的表達產(chǎn)物。重組蛋白純化后經(jīng)Westernblotting分析，表明該蛋白具有較好的反應原性。通過摸索不同誘導時問、溫度和不同IPTG濃度優(yōu)化了重組蛋白的表達條件：用含100mM氨芐的LB培養(yǎng)基在37“C振搖培養(yǎng)，待茵生長至OD值06時，用終濃度為10mM的IPTG誘導，于37℃振蕩培養(yǎng)6h。EcoliBL21(DE3)表達菌超聲波裂解離心后，上清和沉淀電泳，結果

5、表明，蛋白幾乎全部存在于包涵體內。經(jīng)超聲波裂解茵體后，分離包涵體并離心、洗滌，再用8M尿素溶解包涵體，最后用試劑盒純化經(jīng)變性處理的融合蛋白。以原核表達并純化的PrPc重組蛋白為免疫原，按常規(guī)方法免疫PrPc基因敲除小鼠，細胞融合前經(jīng)反復試驗，確定了間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞株的最佳反應條件。即：表達的抗原用PBS以1：1000倍稀釋，以1：1000稀釋的陰、陽性血清分別作為陰、陽性對照，反應條件均為37℃、60rain。取免疫后的