抗豬2型圓環(huán)病毒融合基因的優(yōu)化及其抗病毒效果檢測(cè).pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒(PCV2)是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原體。該病毒還與增生性或壞死性肺炎(PNP)、新生仔豬先天性震顫(CT-AII)、豬皮炎腎炎綜合征(PNDS)、繁殖障礙、腸炎等疾病的發(fā)生有重要關(guān)聯(lián)。豬2型圓環(huán)病毒已成為一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)有嚴(yán)重影響的病毒，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 衣殼蛋白靶向滅活(CTVI)策略是近年來(lái)興起的以蛋白為基礎(chǔ)的抗病毒策略，其基本原理為在病毒復(fù)制的過(guò)程中，將某些核酸酶引入病

2、毒內(nèi)部，降解病毒基因組，從而達(dá)到滅活病毒的目的。其與基于核酸水平的抗病毒策略（如反義核酸，RNAi，核酶等）相比，具有穩(wěn)定性高、特異性好、不產(chǎn)生突變株等優(yōu)點(diǎn)。這種策略為研究抗PCV2病毒基因的篩選提供了新的思路。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在以前的研究中，構(gòu)建了以pIRESneo載體為骨架的JNPC（金黃色葡萄球菌核酸酶置于PCV2核衣殼蛋白氨基端）、PNJC（金黃色葡萄球菌核酸酶置于PCV2核衣殼蛋白氨基端）基因、cap基因真核表達(dá)載體，

3、并通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，獲得了穩(wěn)定表達(dá)JNPC、PNJC兩種融合蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。通過(guò)PCR的方法，鑒定細(xì)胞系基因組上是否有外源基因的整合;通過(guò)RT-PCR、Northern雜交，鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;通過(guò)蛋白免疫印跡、核酸酶活性檢測(cè)，分析細(xì)胞系表達(dá)的融合蛋白。最后對(duì)兩種細(xì)胞系進(jìn)行了抗病毒效果檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)JNPC融合基因結(jié)構(gòu)具有較好的抗病毒效果，但是，該融合基因結(jié)構(gòu)的抗病毒效果還不是很理想。分析其原因可能為(1)密碼子的偏好性;(2)存在

4、異常拼接位點(diǎn)，這一點(diǎn)通過(guò)前期的RT-PCR，克隆測(cè)序等實(shí)驗(yàn)得到了證實(shí)。因此要獲得抗病毒效果更為理想的融合基因結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)一步改造載體結(jié)構(gòu)，對(duì)SN與PCV2衣殼蛋白融合蛋白基因編碼序列(JNPC)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)合成。
　　 本研究主要通過(guò)對(duì)JNPC進(jìn)行重新設(shè)計(jì)合成以及對(duì)載體pIRESNeo進(jìn)行改造（去掉質(zhì)粒pIRESNeo中的人工內(nèi)含子），構(gòu)建了新的真核表達(dá)載體，獲得了穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，并對(duì)融合基因的抗病毒能力進(jìn)行了檢

5、測(cè)。
　　 試驗(yàn)以pattb-INS-CUBC-IRES-Neo-GHPA載體為骨架構(gòu)建了JNPC基因、cap基因真核表達(dá)載體，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入PK15細(xì)胞中，通過(guò)篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)JNPC、cap基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。我們通過(guò)PCR和RT-PCR，來(lái)鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，通過(guò)融合蛋白核酸酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)產(chǎn)物的核酸酶活性。結(jié)果顯示外源基因整合到了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的基因組中，異常拼接現(xiàn)象消失，融合蛋白在細(xì)胞中有

6、表達(dá)，而且表達(dá)的融合蛋白核酸酶活性較好。
　　 對(duì)JNPC、cap、空載體轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及未做轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，采用半定量PCR法和熒光定量PCR法對(duì)各個(gè)樣品中圓環(huán)Ⅱ型病毒DNA含量進(jìn)行檢測(cè)，分析各細(xì)胞系的抗病毒效果。分析結(jié)果顯示，病毒傳遞到第7代以后，JNPC轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中病毒滴度數(shù)幾乎下降至零，而其他幾組細(xì)胞間病毒的滴度數(shù)無(wú)明顯差異。這一結(jié)果證明了我們通過(guò)對(duì)JNPC基因的設(shè)計(jì)合成以及對(duì)載體的改造，獲得了比以前更有