調(diào)控紫杉醇合成轉(zhuǎn)錄因子TcMYC和TcWRKY1的克隆及功能研究.pdf

1、植物細(xì)胞培養(yǎng)是一種最有希望解決緊缺次生代謝物來(lái)源的方法，然而植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物如紫杉醇的產(chǎn)量較低。紫杉醇是來(lái)源于紅豆杉的具有廣譜抗腫瘤作用的二萜類(lèi)生物堿，當(dāng)前市場(chǎng)需求大，藥物來(lái)源緊張。紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇是解決其供需矛盾的有效方法之一。然而，利用紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇同樣存在著產(chǎn)量較低，工業(yè)化成本較高的問(wèn)題。轉(zhuǎn)錄因子可激活特定次生代謝產(chǎn)物系列合成酶的協(xié)同表達(dá)，有效地促進(jìn)目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的合成。因而利用轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)

2、胞系成為解決此問(wèn)題的有效途徑之一。本論文通過(guò)研究MeJA和SA誘導(dǎo)紫杉醇合成酶基因的表達(dá)模式，選擇顯著受到MeJA和SA誘導(dǎo)的紫杉醇合成酶基因作為研究對(duì)象，分別克隆其啟動(dòng)子并鑒定其關(guān)鍵的順式作用區(qū)，采用酵母單雜交技術(shù)篩選轉(zhuǎn)錄因子，并通過(guò)過(guò)表達(dá)和RNAi進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的功能研究，篩選調(diào)控紫杉醇合成的轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)構(gòu)建受微量酒精誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的中國(guó)紅豆杉轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)調(diào)控紫杉醇合成的轉(zhuǎn)錄因子的可控表達(dá)和紫杉醇穩(wěn)定可控合成。
　　本

3、研究取得創(chuàng)新性結(jié)果如下：
　　（1）獲得MeJA和SA誘導(dǎo)紫杉醇合成酶基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)MeJA對(duì)于紫杉醇合成的前期步驟基因如ts、t5αh、tat誘導(dǎo)非常顯著，而SA則顯著誘導(dǎo)紫杉醇合成中后期步驟t13αh，tbt，dbat，dbtnbt，bapt。
　?。?）獲得了紫杉醇合成酶基因ts、dbat的啟動(dòng)子序列。用PLACE和PlantCARE對(duì)分離的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ts啟動(dòng)子中含有典型的JA響應(yīng)元件，包括G-bo

4、x、TGACG等，而在dbat啟動(dòng)子上則含有典型的SA響應(yīng)元件如W-box等。采用農(nóng)桿菌和基因槍分別轉(zhuǎn)化煙草和紅豆杉細(xì)胞，經(jīng)GUS分析發(fā)現(xiàn)ts、dbat基因啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草和紅豆杉細(xì)胞中表達(dá)，且ts啟動(dòng)子的（-239/-131）為JA響應(yīng)區(qū)，dbat啟動(dòng)子的（-940/-240）為SA響應(yīng)區(qū)。
　　（3）以獲得的ts啟動(dòng)子JA響應(yīng)區(qū)和dbat啟動(dòng)子SA響應(yīng)區(qū)為為誘餌，采用酵母單雜交技術(shù)篩選獲得一個(gè)可以和ts啟動(dòng)子JA

5、響應(yīng)區(qū)結(jié)合的bHLB家族類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子TcMYC蛋白，以及一個(gè)可與dbat啟動(dòng)子SA響應(yīng)區(qū)結(jié)合的WRKY家族類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子TcWRKY1，亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)證明其均定位于細(xì)胞核，且EMSA分析發(fā)現(xiàn)TcWRKY1可在體外結(jié)合dbat啟動(dòng)子SA響應(yīng)區(qū)上的2個(gè)W-box。對(duì)TcWRKY1在中國(guó)紅豆杉細(xì)胞中進(jìn)行過(guò)表達(dá)和RNAi分析發(fā)現(xiàn)TcWRKY1能激活dbat基因的表達(dá)，而TcMYC的過(guò)表達(dá)則可激活ts基因的表達(dá)。
　?。?）構(gòu)建微量酒精誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因