產紫杉醇菌株原生質體誘變育種及其生物合成調控的研究.pdf

1、腫瘤和癌癥是目前嚴重威脅人類生命的頑癥之一.對于人類來說,這是僅次于心腦血管疾病的第二大死因.長期以來,世界各國的許多學者對于各種癌癥的防治進行了種種嘗試與探索,但結果都不甚令人滿意.目前,紫杉醇己被國內外一致公認為是一類對多種癌癥具有顯效乃至特效的抗癌新藥.因此,采取各種途徑生產紫杉醇已經成為國內外紫杉醇研究和規(guī)模開發(fā)的熱點.與其它方法相比,微生物發(fā)酵法生產紫杉醇的優(yōu)勢是顯而易見的.本試驗采用單因子試驗設計方法,對影響紫杉醇產生菌UV

2、<,40-19>.合成紫杉醇的培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液初始pH、搖床轉數進行了探討,確定了最佳培養(yǎng)條件;通過單因子和正交試驗設計研究了前體物、誘導子和抑制劑及其協(xié)同對紫杉醇產生菌合成紫杉醇的調控作用.同時,對紫杉醇菌株UV<,40-19>的原生質體制備、再生及紫外線和亞硝基胍復合誘變育種進行了研究篩選潮霉素抗性突變株.另外,通過同工酶技術、RAPD、AFLP和ITS序列分析對出發(fā)菌株NCEU-1與兩高產株UV<,40-19>和UL<,50-6>

3、間的遺傳差異進行了研究.此外,利用Southern blotting技術對細胞培養(yǎng)中紫杉二烯合成酶是否也存在于通過微生物發(fā)酵法生產紫杉醇的生物合成途徑中進行了初探.目前,在利用紫杉醇產生菌合成紫杉醇的研究領域內,尚未見有關本試驗研究方面的報道.因此,本試驗在這幾方面研究取得的突破性進展,為通過微生物發(fā)酵法生產抗癌藥物紫杉醇的生物合成調控和構建高產基因工程菌株提供了強有力的理論指導;為早日實現利用微生物發(fā)酵法生產抗癌藥物紫杉醇的工業(yè)化生產

4、、創(chuàng)造巨大經濟效益和社會效益展示了美好的前景. 本試驗的主要研究結果如下: 1、紫杉醇產生菌UV<,40-19>生物合成紫杉醇的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為:S-7發(fā)酵液初始pH5.5,搖床溫度25℃,搖床轉速150r/min; 2、向S-7發(fā)酵培養(yǎng)基添加適當濃度的前體物、代謝旁路抑制劑和誘導子對微生物發(fā)酵法生產紫杉醇的合成代謝進行綜合調控可以大大提高紫杉醇的產量: 3、采用試驗得出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件,以篩選出的優(yōu)化培養(yǎng)基

5、作為發(fā)酵培養(yǎng)基,菌株UV<,40-19>發(fā)酵液中紫杉醇含量為493.74μg/L,是改良S-7發(fā)酵培養(yǎng)基的1.25倍; 4、Nodulisporium sylviforme 紫杉醇產生菌UV<,40-19>原生質體制備及再生的最佳條件為:每 250mg 濕菌絲體加酶液1 mL(0.7mol/LNaCl配制由3﹪溶壁酶+3﹪纖維素酶+4﹪蝸牛酶+1﹪的溶菌酶組成的復合酶系,pH5.5～6.0)→0℃振蕩酶解5h→酶解液用三層無菌鏡

6、頭紙過濾→3000r/min離心 10min,收集原生質體;將獲得的原生質體在含NaCl∶KCl∶葡萄糖(5∶3∶2,v/v/v,終濃度均為0.7mol/L)的PDA再生培養(yǎng)基上,采用雙層平板培養(yǎng)法再生制備到的原生質體; 5、Nodulisporium sylviforme 紫杉醇產生菌UV<,40-19>原生質體誘變的適宜條件為:將原生質體懸液經過0.8mg/mL NTG、處理15min 后,在電磁攪拌下,用紫外燈(30w,距

7、離3 0cm)照射處理40s; 6、在潮霉素含量為90μg/mL的抗性平皿中篩選出了一株高產紫杉醇的原生質體誘變菌株-UN<,05-3>,其產量從出發(fā)菌株紫杉醇的產量 (376.38±8.41)μg/L提高至(478.12±11.36)μg/L; 7、探索出了一種新的、快速而高效的樹狀多節(jié)孢紫杉醇產生菌基因組DNA的提取方法; 8、通過同工酶技術、RAPD、AFLP和ITS序列分析表明,出發(fā)菌株與誘變菌株之間以及

8、兩誘變菌株之間都存在明顯差異,為進一步研究與紫杉醇生物合成相關基因及誘變株產量提高的分子機制奠定了基礎; 9、從東北紅豆杉 (Taxus cuspidata) 樹葉中獲得了紫杉二烯合成酶基因片段克隆,用GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blast程序對此個序列與GenBank中收錄的序列進行了同源性比較,同源性達到98﹪; 10、首次證實了紫杉二烯合成酶基因也存在于紫杉醇產生菌--