中國紅豆杉中調(diào)控Taxol合成的TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆及分析.pdf

1、紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取的一類具有獨特抗癌功效的次級代謝產(chǎn)物，目前市場供需矛盾突出。植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇是解決這一矛盾的有效方法之一，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的明晰有助于提高其產(chǎn)業(yè)化水平。轉(zhuǎn)錄因子是植物次生代謝產(chǎn)物合成中最為重要的調(diào)節(jié)因子之一。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的超基因家族，對植物的生長、發(fā)育、防御、代謝等生理活動具有重要作用。本文對中國紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的TcWRKY基因進行了篩選和克隆，并初步探究了TcWRKY轉(zhuǎn)錄因

2、子在紫杉醇合成過程中的功能和機理。本研究主要取得了以下結(jié)果：
　?。?）中國紅豆杉中TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子的篩選與進化分析。本課題從中國紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[1]中共篩選到61個TcWRKY基因。對61個TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子進行進化和聚類分析發(fā)現(xiàn)，屬于I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子有16個，II類共44個，III類則只有1個。而44個II類TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子又分屬于IIa（8個）、IIb（10個）、IIc（14個）、IId（5個）和IIe（7

3、個）5個亞類。
　?。?）TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子響應激素誘導的表達特征分析。根據(jù)聚類分析和序列比對結(jié)果，分別在各亞類中選取1個TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子進行進一步探究：TcWRKY8（IIc類）、TcWRKY20（III類）、TcWRKY26（I類）、TcWRKY41（IIe類）、TcWRKY44（IId類）、TcWRKY47（IIa類）和TcWRKY52（IIb類）。對其進行MJ和SA誘導后，發(fā)現(xiàn)TcWRKY44、TcWRKY47在MJ

4、和SA誘導后均有明顯上調(diào)；MJ對TcWRKY8、TcWRKY20、TcWRKY26、TcWRKY41都有顯著上調(diào)作用，而SA對以上4個基因均有明顯抑制；TcWRKY52對MJ沒有明顯響應且受到SA的顯著抑制。
　?。?）TcWRKY基因超表達對紫杉醇合成相關(guān)基因的影響。選取顯著響應于 MJ的TcWRKY8、TcWRKY20、TcWRKY26、TcWRKY44、TcWRKY47基因，分別在中國紅豆杉細胞中超表達后，研究了其對紫杉醇合

5、成相關(guān)酶基因DBAT和T5H，及紫杉醇合成調(diào)控因子基因TcERF12和TcERF15表達的影響。其中，TcWRKY44超表達明顯抑制了以上4個基因的表達；TcWRKY20、TcWRKY26超表達能在不同程度上提高以上4個基因的表達水平；而 TcWRKY8、TcWRKY47超表達提高了DBAT、T5H、TcERF15的表達，抑制了TcERF12的表達。
　?。?）TcWRKY47轉(zhuǎn)錄因子與 DBAT啟動子作用方式的探究。由于TcWR

6、KY47能夠明顯響應MJ和SA，且對紫杉醇合成相關(guān)酶具有一定的正向調(diào)控作用，本課題研究了TcWRKY47轉(zhuǎn)錄因子與DBAT啟動子在中國紅豆杉細胞內(nèi)的作用方式。通過突變DBAT啟動子上的W-box后發(fā)現(xiàn)，當有WA-box的存在或只有WC-box存在時，TcWRKY47與DBAT啟動子的結(jié)合較弱，當 WB-box存在且不存在WA-box時，TcWRKY47與DBAT啟動子的結(jié)合作用有較明顯提高。以上結(jié)果說明，TcWRKY47與DBAT啟動子