紅豆杉韌皮部分化、發(fā)育關(guān)鍵基因的克隆及功能分析.pdf

1、紅豆杉（Taxus），也稱紫杉，是裸子植物的一個(gè)屬，包含至少14個(gè)種。紫杉醇(Taxol)是從紅豆杉樹皮中分離提取到的天然抗腫瘤物質(zhì)，是迄今為止最具抗癌活性的天然化合物之一，但產(chǎn)量并不高(僅占樹皮干重的0.01-0.02％)。雖然在尋找及擴(kuò)大紫杉醇藥源途徑的研究上取得了極大的進(jìn)展，但是伴隨用于醫(yī)療的紫杉醇需求不斷增加，紫杉醇的供求矛盾還沒有得到根本解決。本論文以紅豆杉(Taxus chinensis)為研究材料，利用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)

2、分析剝皮后不同時(shí)期再生組織的基因表達(dá)模式，發(fā)掘參與維管組織形成的相關(guān)基因。利用RT-PCR方法從紅豆杉樹皮中克隆得到4個(gè)紅豆杉LBD(LATERALORGAN BOUNDARIES DOMAIN)和3個(gè)APL(ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT)基因的cDNA序列，篩選關(guān)鍵基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究，初步揭示重要候選基因?qū)S管組織尤其是韌皮部發(fā)育的影響，為培育韌皮部增多（樹皮增厚）的轉(zhuǎn)基因紅豆杉植株提供理論依據(jù)和手段。主要研

3、究結(jié)果如下:
　　1.建立了紅豆杉次生維管組織再生實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。顯微組織觀察發(fā)現(xiàn)，在紅豆杉的次生維管組織再生過(guò)程中，韌皮部和形成層的再生并不需要細(xì)胞脫分化形成愈傷細(xì)胞狀態(tài)，而是由未成熟的木質(zhì)部細(xì)胞及射線細(xì)胞分化而來(lái)。在紅豆杉剝皮后的第24天出現(xiàn)了不連續(xù)的分生組織細(xì)胞，隨后，維管形成層形成，進(jìn)而開始分化出韌皮部和木質(zhì)部。到第60天時(shí)，形成結(jié)構(gòu)上完整的維管系統(tǒng)。
　　2.利用高通量測(cè)序技術(shù)(Illumina HiSeqTM2000)

4、對(duì)紅豆杉剝皮后不同時(shí)期再生組織進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，測(cè)序共得到165557061個(gè)Clean Reads， Clean Reads得到的測(cè)序總堿基數(shù)量為16.55 G;通過(guò)組裝共得到不低于200 nt的224010個(gè)Contigs。通過(guò)Trinity組裝，共得到156713個(gè)unigenes。這些unigenes對(duì)紅豆杉維管組織分化發(fā)育研究提供了重要的基因資源。
　　3.在紅豆杉剝皮再生組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索LBD基因，并根據(jù)獲得

5、的基因序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR方法克隆獲得4個(gè)紅豆杉TcLBDs基因。根據(jù)與擬南芥LBD家族同源性比對(duì)，分別命名為TcLBsD1、TcLBD6、TcLBD11和TcLBD15，序列分析表明這4個(gè)基因的開放閱讀框（ORF）分別為549 bp、687 bp、462 bp和540 bp，推測(cè)分別編碼182個(gè)、228個(gè)、153個(gè)和179個(gè)氨基酸(AA)。這4個(gè)基因在N端存在著LBD類轉(zhuǎn)錄因子特有的LOB結(jié)構(gòu)域，都屬于第一類(classⅠ)

6、LBD基因。
　　4.TcLBDs的組織表達(dá)譜分析表明:TcLBD1在莖和木質(zhì)部（含形成層）中表達(dá)量明顯高于根、葉片和韌皮部（含形成層）中的表達(dá)量;TcLBD6主要在根和莖中表達(dá);TcLBD11僅在根中表達(dá)量最低，其他組織部位均高表達(dá);而TcLBD15在根和韌皮部（含形成層）中表達(dá)量較高，其他組織表達(dá)量均低。其在紅豆杉剝皮后不同時(shí)期再生組織間的表達(dá)模式顯示，TcLBD1與TcLBD11基因表達(dá)量在紅豆衫剝皮后6天時(shí)達(dá)到最高，整體呈

7、上調(diào)表達(dá);TcLBD6與TcLBD15表達(dá)水平在剝皮后18天后顯著上調(diào)。
　　5.我們篩選表達(dá)量顯著變化的TcLBD11與TcLBD15基因，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體pBI121-TcLBD11和pBI121-TcLBD15。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將TcLBD11與TcLBD15基因轉(zhuǎn)化銀腺楊84K和擬南芥。TcLBD11-oe轉(zhuǎn)基因楊樹表現(xiàn)為韌皮部的發(fā)育受抑制，尤其韌皮纖維處于散亂分布。TcLBD11-oe轉(zhuǎn)基因擬南芥表型不正常，葉片矮化且卷

8、曲，4周時(shí)簇生葉預(yù)示莖尖分生組織發(fā)育的改變，同時(shí)還延遲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，同時(shí)檢測(cè)到AtAPL、AtNAC45/86基因都是下調(diào)表達(dá)。TcLBD15-oe轉(zhuǎn)基因楊樹的表型特征是植株的高度顯著提高，莖部直徑明顯增粗并且次生韌皮部的厚度也顯著增加。TcLBD15-oe轉(zhuǎn)基因擬南芥主莖增粗，同時(shí)檢測(cè)了AtAPL、AtNA C45/86與TcLBD11的相互作用，除了AtNAC45之外，其余基因都是下調(diào)表達(dá)。
　　6.利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PC

9、R)方法克隆得到三個(gè)紅豆杉TcAPLs基因的cDNA序列，分別命名為TcAPL1、TcAPL2和TcAPL3，序列分析表明3個(gè)基因的開放閱讀框分別為1650bp、1341 bp和1167 bp，推測(cè)分別編碼549個(gè)、446個(gè)和388個(gè)氨基酸，它們都包含保守的MYB結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，TcAPL1和TcAPL2兩個(gè)基因主要在根、莖、葉片和韌皮部（含形成層）中均高表達(dá);TcAPL3在葉片中表達(dá)量較高，而在根和木質(zhì)部（含形成層）表達(dá)較低。在紅豆