紫杉醇前體合成途徑兩個(gè)關(guān)鍵酶基因克隆和分析.pdf

1、紫杉醇是從藥用植物紅豆杉中分離出的具有抗癌作用的天然產(chǎn)物，是最好的天然抗癌藥物之一。由于紅豆杉生長緩慢且紫杉醇含量非常低，所以完全不能滿足患者的需求。開展紅豆杉的基因工程研究，為解決藥源缺乏的問題提供了嶄新的思路。因此，開展紫杉醇生物合成途徑的分子生物學(xué)研究，是開展紅豆杉基因工程的首要工作。 1.紫杉醇前體生物合成源于新近發(fā)現(xiàn)的MEP途徑。為研究紫杉醇前體生物合成途徑的分子生物學(xué)，本文采用 cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid

2、amplification of cDNA ends，RACE)方法從曼地亞紅豆杉(Taxus media)中首次克隆了MEP途徑上兩個(gè)關(guān)鍵酶基因的全長cDNA，包括曼地亞紅豆杉2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶基因(2-C-Methyl--D-erythritol4-phosphate cytidyltransferase，MECT)和曼地亞紅豆杉2-C-甲基赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸合成酶基因(TmMECP~)，并對這些基

3、因進(jìn)行了詳盡的分析和功能驗(yàn)證。 2.2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶，是紫杉醇前體生物合成MEP途徑上的第三個(gè)酶。驗(yàn)采用RACE方法，第一次從曼地亞紅豆杉中獲得了MECT基因(命名為TmMECT)。TmMECT全長1301 bp，包括5’和3’非翻譯區(qū)、polyA尾巴和一個(gè)編碼939 bp的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，它編碼一條312個(gè)氨基酸殘基的MECT蛋白質(zhì)，其分子量預(yù)測為34.

4、33kDa，等電點(diǎn)為8.96；組織差異表達(dá)研究顯示，TmMECT在紅豆杉根、葉、樹皮、莖中均有表達(dá)，在葉和樹皮中表達(dá)量較高。顏色互補(bǔ)試驗(yàn)表明TmMECT可以加速β-胡蘿卜素的積累。對TmMECT基因的克隆和功能分析將會(huì)有助于在分子水平上更好地了解MECT在紫杉醇生物合成中的作用。 3. 2-C-甲基赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸合成酶(2C-methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate synthas

5、e，MECPS)是紫杉醇前體生物合成MEP途徑中第五步反應(yīng)酶。利用RACE技術(shù)，首次從曼地亞紅豆杉中獲得MECPS基因(命名為TmMECPS)。根據(jù)生物信息學(xué)分析TmMECPS基因cDNA全長為899 bp，含有一個(gè)726 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)由241個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)：預(yù)測的分子量約為26.1 kDa，等電點(diǎn)(pI)為8.22。同源比對與生物信息學(xué)分析表明，TmMECPS蛋白與其它物種的MECPS蛋白具有較高的同