亞急性瘤胃酸中毒(SARA)對(duì)山羊肝臟免疫機(jī)能的影響.pdf

1、反芻動(dòng)物亞急性瘤胃酸中毒（Subacuteruminalacidosis，SARA）是一種多發(fā)性代謝性疾病，常見(jiàn)于現(xiàn)代化的奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，該病易引起瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系的紊亂、蹄葉炎、肝臟膿腫及乳成分結(jié)構(gòu)改變，嚴(yán)重影響奶牛健康和生產(chǎn)性能。目前關(guān)于SARA的報(bào)道大多集中于診斷防治及生化指標(biāo)的檢測(cè)上，但是關(guān)于SARA對(duì)肝臟免疫機(jī)能影響的研究甚少。肝臟免疫機(jī)能的改變可能會(huì)導(dǎo)致肝臟物質(zhì)代謝的紊亂，從而影響乳成分前體物的重分配，引起乳品質(zhì)的下降。本文旨在

2、研究高精料誘導(dǎo)SARA時(shí)瘤胃異常代謝產(chǎn)物脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）含量的變化，以及對(duì)肝臟免疫機(jī)能的影響。
　　1.SARA對(duì)干乳期山羊肝臟免疫和下丘腦食欲調(diào)節(jié)因子的影響
　　實(shí)驗(yàn)選用12只本地干乳期山羊，隨機(jī)分為對(duì)照組和SARA組，分別飼喂精粗比為40∶60和60∶40的飼料，實(shí)驗(yàn)期21天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集瘤胃液、血液、肝臟等樣品，pH計(jì)迅速測(cè)定瘤胃液pH值，并測(cè)定瘤胃液中乳酸含量;采用酶聯(lián)免疫吸附

3、方法(ELISA)檢測(cè)血液中細(xì)胞因子TNF-α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α），IL-6(Interleukin-6，IL-6)、IL-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和急性期蛋白血清淀粉樣蛋白A(SerumamyloidA，SAA)、觸珠蛋白（haptoglobin，HP）、脂多糖結(jié)合蛋白（Lipopolysaccharide-bindinprotein）的濃度;Real-timePCR和We

4、sternblot方法從mRNA和蛋白水平檢測(cè)了TLR4通路相關(guān)基因及下游細(xì)胞因子在肝臟、下丘腦、海馬中的表達(dá)水平，并檢測(cè)了肝臟中急性期蛋白和下丘腦攝食調(diào)節(jié)功能相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示:(1)精粗比60∶40日糧飼喂2周后成功建立山羊SARA模型（SARA組），采食后瘤胃液pH值低于5.8且持續(xù)時(shí)間約3h，而精粗比為4∶6組（對(duì)照組）山羊瘤胃液pH均高于6.0;(2)乳酸在采食后2～4小時(shí)之間下降，6～8小時(shí)逐漸增加，但兩組間無(wú)顯著差異

5、（P＞0.05）。(3)SARA組山羊血漿中IL-1β、HP含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，血漿TNF-α水平相對(duì)于對(duì)照組有升高趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1）。(4)肝臟中TLR4（Toll-likereceptor4，Toll樣受體4）及細(xì)胞因子表達(dá)沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但急性期蛋白SAA和HPmRNA顯著上調(diào)（P＜0.05）。(5)SARA組下丘腦TLR4、髓樣分化因子（Myeloiddifferentiationprim

6、aryresponsegene88，MyD88）及TNF-α表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），刺鼠相關(guān)蛋白（Agouti-relatedprotein，AgRP）基因表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），神經(jīng)肽Y（NeuropeptideY,NPY）基因表達(dá)有下調(diào)的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1），但SARA組山羊下丘腦中前阿片黑素細(xì)胞皮質(zhì)激素(Pro-opiomelanocortin，POMC)和促黑激素受體4（Melanocortinreceptor4

7、，MCR4）的基因表達(dá)均無(wú)顯著性變化（P＞0.05）。
　　2.SARA對(duì)泌乳中期山羊泌乳和肝臟免疫機(jī)能的影響
　　(1)短期試驗(yàn):選用7只處于泌乳中期的本地山羊，手術(shù)安裝永久性瘤胃瘺管，隨機(jī)分為兩組，分別飼喂精粗比為40∶60和60∶40的飼料，2×2拉丁方設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)分兩期，每期14d。采集瘤胃液并測(cè)定pH和乳酸含量;檢測(cè)血液中LPS和細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平;檢測(cè)肝臟TLR4和細(xì)胞因子的基因表達(dá)。結(jié)

8、果:精粗比60∶40日糧飼喂泌乳期山羊2周后成功誘導(dǎo)SARA（SARA組），采食后瘤胃液pH值低于5.8且持續(xù)時(shí)間約6h，SARA組山羊瘤胃液中乳酸和LPS含量都顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。SARA對(duì)血漿中TNF-α和IL-1β含量有顯著影響（P＜0.05），但不影響肝臟TLR4、TNF-α、IL-1βmRNA的表達(dá)（P＞0.05）。以上結(jié)果提示:SARA導(dǎo)致瘤胃中乳酸的積累以及瘤胃異常代謝產(chǎn)物L(fēng)PS的增加，但泌乳山羊經(jīng)歷短期SAR

9、A時(shí)肝臟對(duì)LPS不產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，不改變TLR4及下游信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄水平。
　　(2)長(zhǎng)期試驗(yàn):選擇8只泌乳中期的薩能奶山羊，手術(shù)安裝永久性瘤胃瘺管，隨機(jī)分為對(duì)照組（n=4）和SARA組(n=4)，分別飼喂精粗比為40∶60扣60∶40的飼料，實(shí)驗(yàn)期為9周。每天記錄山羊的產(chǎn)奶量和健康狀況;每?jī)芍軠y(cè)一次乳成分含量和瘤胃pH值;采樣后測(cè)定血中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及急性期蛋白SAA、LBP、HP的含量;檢測(cè)肝臟中TLR4、TLR2

10、、MyD88、CD14，細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、急性期蛋白SAA、C-反應(yīng)蛋白(C-reactionprotein，CRP)、LBP、HP的基因表達(dá);采用westernblot方法檢測(cè)肝臟組織中TLR4和p65的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示:(1)高精料(60％)飼喂山羊2周后山羊出現(xiàn)SARA現(xiàn)象，飼喂4周后由于對(duì)飼料的適應(yīng)和瘤胃緩沖能力的增加瘤胃pH增加，但仍顯著低于對(duì)照組山羊（P＜0.05）。與對(duì)照組山羊相比，SARA山羊采食前瘤

11、胃液中乳酸濃度有升高趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1）;LPS濃度無(wú)顯著變化（P＞0.05）。(2)SARA組奶產(chǎn)量一直極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）;第6～9周乳蛋白和乳脂水平都顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），第2周乳脂水平極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）;第8周乳糖水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），乳中體細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組。(3)與對(duì)照組相比，SARA組山羊血漿TNF-α水平有顯著影響(P＜0.05)，血漿IL-6濃度有升高趨勢(shì)（0

12、.05＜P＜0.1）;血漿急性期蛋白SAA顯著升高（P＜0.05），HP有升高趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1），LBP水平?jīng)]有顯著差異（P＞0.05）。(4)與對(duì)照組相比，SARA組山羊肝臟中TLR4mRNA水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，蛋白表達(dá)也有升高跡象，p65表達(dá)有。TLR2、CD14、MyD88和TNF-α表達(dá)沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），細(xì)胞因子IL-1β顯著上調(diào)(P＜0.05);急性期蛋白SAA、CRP、HP表達(dá)顯著增加(P＜0