布魯氏菌介導(dǎo)的宿主小泛素化及抗凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、類泛素化修飾主要是參與細(xì)胞周期調(diào)控、信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖與分化、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA修復(fù)以及應(yīng)激反應(yīng)等多種細(xì)胞功能調(diào)控。目前,有關(guān)類泛素對細(xì)菌介導(dǎo)的細(xì)胞生物進(jìn)程變化研究較少。布魯氏菌是一種典型的兼性胞內(nèi)菌,寄生在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制繁殖,對宿主細(xì)胞功能有很大的影響。因此,研究布魯氏菌介導(dǎo)對細(xì)胞內(nèi)類泛素的變化與布魯氏菌引起凋亡的影響具有重要意義。本研究主要包括以下幾方面:
　　1.鼠源類泛素蛋白SUMO1/2/3的原核表

2、達(dá)、純化及抗體的制備
　　經(jīng)鑒定、測序成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-SUMO1/2/3。將其在大腸桿菌中表達(dá),可見相對分子質(zhì)量約為30KD的蛋白帶,而且在6h時表達(dá)量最高。用蛋白純化系統(tǒng)純化類泛素融合蛋白,免疫兔子,制備多克隆抗體血清經(jīng)Western-blot分析表明表達(dá)的蛋白具良好的反應(yīng)原性。
　　2.布魯氏菌介導(dǎo)對細(xì)胞類泛素表達(dá)影響的研究
　　布魯氏菌M5-90和16M菌株分別侵染巨噬細(xì)胞后,通過免疫印跡方法和熒光實(shí)

3、時定量方法分別檢測細(xì)胞中類泛素SUMO1蛋白表達(dá)水平與SUMO1/2/3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示:布魯氏菌M5-90和16M菌株侵染巨噬細(xì)胞后,SUMO1蛋白水平與mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12h內(nèi)都是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,M5-90侵染組SUMO1表達(dá)量在4h時最高(p<0.01),而16M侵染組在8h時表達(dá)量最高(p<0.01);在布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞時細(xì)胞中SUMO2 mRNA水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,M5-90侵染組SUMO2

4、mRNA水平在4h和8h要明顯高于對照組與16M侵染組(p<0.01);SUMO3 mRNA水平在16M侵染時要顯著高于對照組和M5-90組,M5-90組8h時高于對照組(p<0.05),而在12h時低于對照組。
　　3.類泛素SUMO1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對布魯氏菌胞內(nèi)生存與細(xì)胞凋亡的影響
　　成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-SUMO1。通過熒光實(shí)時定量方法測定pcDNA-SUMO1質(zhì)粒在巨噬細(xì)胞中最佳轉(zhuǎn)染條件;通過瞬時轉(zhuǎn)

5、染重組質(zhì)粒pcDNA-SUMO1使SUMO1在細(xì)胞中過量表達(dá),用布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞后,用LgCFU方法檢測SUMO1對布魯氏菌胞內(nèi)存活和細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染pcDNA-SUMO1質(zhì)粒組的胞內(nèi)M5-90菌數(shù)量在12h內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢,4h后轉(zhuǎn)染pcDNA-SUMO1質(zhì)粒的胞內(nèi)菌數(shù)顯著低于對照組(p<0.05),轉(zhuǎn)染pcDNA-SUMO1質(zhì)粒的胞內(nèi)16M菌數(shù)量在4h后呈現(xiàn)上升趨勢,顯著低于對照組(p<0.05);SUMO1在細(xì)胞中

6、過量表達(dá),用布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)檢測SUMO1對布魯氏菌介導(dǎo)的凋亡的影響,結(jié)果顯示:布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞后,各組細(xì)胞凋亡率都呈現(xiàn)上升趨勢,轉(zhuǎn)染pcDNA空質(zhì)粒組與對照組差異不顯著,轉(zhuǎn)染pcDNA-SUMO1質(zhì)粒組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(p<0.05)。
　　以上研究結(jié)果表明:制備兔抗SUMO1/2/3蛋白多克隆抗體具有良好的反應(yīng)原性;布魯氏菌在侵染細(xì)胞時能夠引起SUMO1蛋白表達(dá)與SUMO1/2/3mRNA轉(zhuǎn)錄水