抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶鑒定及PTEN泛素化調控乳腺癌細胞凋亡的研究.pdf

1、研究背景與目的
　　人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphataseandtensionhomologuedeletedfromchromosome10，pten，又叫做mmac1或tep1)屬于PTP(proteintyrosinephosphatases)基因家族，定位于人類染色體10q23.3，具有脂質磷酸酶和蛋白質磷酸酶雙重活性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個具有雙重磷酸酶活性的抑癌蛋白。PTEN的脂質磷

2、酸酶活性能夠特異性地使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3)的3位磷酸基團去磷酸化，拮抗磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)的功能，從而抑制PI3K下游Akt信號通路的轉導，從而產(chǎn)生抑制細胞生長、增殖和遷移等生物學行為的效應。目前已知，PTEN蛋白是繼p53之后發(fā)現(xiàn)的與腫瘤關系最為密切的抑癌蛋白之一，在

3、泌尿系統(tǒng)腫瘤和生殖系統(tǒng)腫瘤等諸多惡性腫瘤中均可檢測到pten基因的突變或缺失。近來的研究發(fā)現(xiàn)細胞內PTEN總蛋白量的減少亦與腫瘤的發(fā)生密切相關。
　　PTEN的研究已經(jīng)成為生命科學和醫(yī)學領域的一個熱點方向，PTEN的生理功能在人類多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的重要性已經(jīng)被越來越多的研究者證實和承認。
　　現(xiàn)有報道表明，在多種人類腫瘤中能夠檢測到pten的啟動子區(qū)被甲基化修飾使基因表達受到抑制;pten基因的轉錄亦會受到p53等眾多上

4、游分子的精細調節(jié);在轉錄后水平，PTEN蛋白的表達受到非編碼RNAmiR-21及miR-19等的抑制;在翻譯后水平，PTEN可被泛素化、磷酸化和乙?；揎棧瑥亩淖働TEN在細胞內的定位、蛋白的空間構象、蛋白穩(wěn)定性和脂質磷酸酶活性等3（圖2）。
　　PTEN的功能如此重要，其生理活性和蛋白穩(wěn)定性也會受到嚴格而精密的調控。已有研究報道在多種人類腫瘤中能夠可檢測到pten基因啟動子被甲基化修飾，從而使基因沉默;在轉錄后水平，PTEN蛋

5、白的表達受到非編碼RNAmiR-21及miR-19等的抑制;在翻譯后水平，PTEN可被泛素化、磷酸化和乙酰化修飾，從而改變PTEN的細胞內定位、蛋白空間構象、蛋白穩(wěn)定性和自身磷酸酶活性等。
　　泛素化降解與去泛素化修飾的動態(tài)平衡在蛋白水平的精細調節(jié)中具有重要地位。泛素連接酶(ubiquitinligase，E3)與去泛素化酶(deubiquitinase，DUB)的功能相互拮抗，共同維持蛋白質的穩(wěn)態(tài)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的能夠促進PT

6、EN泛素化的E3共有5個分子，分別為Nedd4-1、WWP2、CHIP(CterminusofHsc70-interactingprotein)、XIAP和TRIM27/RFP，而具有促進PTEN去泛素化修飾功能的DUB只有HAUSP和USP13被發(fā)現(xiàn)。其中HAUSP只能夠特異性地去除PTEN的單泛素化修飾，進而改變PTEN蛋白的細胞內定位，但并不會對PTEN蛋白的穩(wěn)定性和蛋白的總量產(chǎn)生影響。因此，能夠特異性去除PTEN蛋白的多聚泛素化

7、修飾、抑制PTEN蛋白降解的DUB就只有USP13被發(fā)現(xiàn)，新的能夠維持PTEN蛋白穩(wěn)定性的DUB分子還有待于進一步的發(fā)掘與研究。
　　FoxO（ForkheadboxO）轉錄因子是細胞生命活動的重要調控分子，在細胞的多項生命活動中發(fā)揮著重要作用。FoxO蛋白與人類多種腫瘤相關。Akt是FoxO蛋白重要的上游調控分子之一。活化的Akt能夠直接使FoxO家族蛋白磷酸化，促進其降解，抑制其下游靶基因的轉錄，從而影響細胞周期和細胞凋亡。P

8、TEN作為PI3K/Akt信號通路負向調控的核心分子，其蛋白水平對于FoxO家族分子的功能發(fā)揮具有重要意義。
　　本研究針對這一問題，鑒定了對PTEN蛋白水平具有正向調節(jié)作用的DUB，研究其在維持PTEN蛋白穩(wěn)定中所發(fā)揮的作用及產(chǎn)生上述效應的分子機制;明確泛素連接酶CHIP對PTEN及其下游凋亡通路的影響。
　　研究方法
　　人源DUB家族根據(jù)蛋白的結構和組成特點可分為5個亞家族，分別是UCH、USP、OTU、Jose

9、phin和JAMM/MPN+家族。我們圍繞PTEN的DUB鑒定這一科學問題，從人源DUB家族全部成員中通過無偏性篩選，分別用等量的DUB過表達載體轉染HCT116細胞，Westernblot檢測細胞內源PTEN水平，篩選出能夠穩(wěn)定PTEN蛋白水平的去泛素化酶分子OTUD3(OTUdomain-containingprotein3)。免疫共沉淀實驗檢測OTUD3與PTEN的相互作用，并確定相互作用區(qū)域。過表達OTUD3，檢測細胞內Akt通

10、路的活性。構建OTUD3敲低的MCF7細胞穩(wěn)定株，檢測OTUD3對細胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響。免疫組化檢測結直腸癌組織樣本、Westernblot檢測乳腺癌組織樣本中OTUD3與PTEN的蛋白水平。通過DNA測序篩查乳腺癌組織中OTUD3與PTEN的天然突變體，并構建相應的過表達載體，檢測這些突變對PTEN蛋白半衰期的影響。在乳腺癌MCF7細胞和乳腺上皮細胞MCF10A細胞中分別過表達PTEN特異性泛素連接酶CHIP，檢測細胞內Ak

11、t通路的活性、FoxO家族蛋白的活性、Bim的分子水平以及對凋亡的影響。免疫組化檢測乳腺癌組織中CHIP與Bim的表達水平。
　　結果
　　1.OTU亞家族中的成員OTUD3在過表達的情況下可以特異性上調PTEN蛋白水平，而OTU亞家族的其他成員分子沒有上調PTEN蛋白水平的功能，表明OTUD3對PTEN的調節(jié)具有特異性。通過RNAi技術敲低內源OTUD3可引起PTEN蛋白水平的顯著下降，且這一現(xiàn)象在多種細胞系中可穩(wěn)定重復。

12、但在細胞內過表達OTUD3喪失去泛素化酶活性的突變體OTUD3C76A不但不能使PTEN水平上升，反而使細胞內源PTEN的蛋白水平顯著下降，出現(xiàn)十分明顯的顯性“負”效應。表明細胞內源OTUD3蛋白對PTEN的調節(jié)作用在PTEN的穩(wěn)定性維持上具有重要地位，且OTUD3的這一功能依賴于其去泛素化酶活性。
　　2.OTUD3能夠直接與PTEN發(fā)生相互作用，介導二者相互作用的區(qū)域分別為OTUD3的OTU結構域與PTEN的C2結構域，且相互

13、作用不依賴于OTUD3的去泛素化酶活性。本課題匯總了既往文獻中報道的腫瘤組織中PTENC2結構域的突變，分別為PTEN△M199、PTENP246L、PTEN△T319、PTENF341V、PTENV343E、PTENL345Q、PTENT348I、PTEN1-319和PTEN1-342。在這些PTEN突變蛋白中，PTEN△M199、PTENF341V和PTEN1-319能夠使PTEN喪失與OTUD3的結合能力，從而使PTEN蛋白穩(wěn)定性

14、降低，半衰期縮短，蛋白水平下降。
　　3.細胞和分子水平的測試表明，OTUD3敲低所產(chǎn)生的分子效應與細胞學效應與PTEN敲低所產(chǎn)生的效應極為相似，均可導致Akt通路的過度激活，使細胞的增殖加快、侵襲能力增強、對順鉑誘導的細胞凋亡敏感性降低。OTUD3敲低對腫瘤細胞侵襲能力的影響尤其顯著，在裸鼠成瘤實驗中，OTUD3敲低細胞與PTEN敲低細胞均可在裸鼠體內發(fā)生肝臟轉移，且二者嚴重程度相仿，使得裸鼠在皮下注射細胞后四周內即發(fā)生死亡，裸

15、鼠成瘤實驗無法完成。這一發(fā)現(xiàn)表明OTUD3在抑制腫瘤細胞的遠處轉移中扮演著重要角色。OTUD3的水平下降或缺失能夠顯著促進腫瘤的遠處轉移。
　　4.OTUD3與PTEN在人類結直腸癌組織當中亦呈明顯的正相關，且二者在腫瘤組織中的定位存在一致性。
　　5.我們在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了OTUD3的兩個突變蛋白，分別為OTUD3R79T和OTUD3E86K，在乳腺癌細胞系MCF7中分別梯度過表達OTUD3野生型、OTUD3R79T和O

16、TUD3E86K突變蛋白，發(fā)現(xiàn)過表達OTUD3R79T能夠使PTEN蛋白水平上調，與梯度過表達野生型OTUD3對PTEN的調控效應相似;而梯度過表達OTUD3E86K卻得到與過表達野生型OTUD3相反的效應，細胞內源PTEN水平隨著OTUD3E86K表達量的增加而顯著下降。這一現(xiàn)象提示OTUD3R79T依然具有維持PTEN蛋白穩(wěn)定性的功能，該突變并沒有影響OTUD3分子的去泛素化酶活性，而OTUD3E86K則與OTUD3酶活突變體OTU

17、D3C76A類似，過表達會出現(xiàn)“顯性負”效應，成為PTEN水平的負向調控分子，提示這一位點氨基酸的突變可能影響到了OTUD3的去泛素化酶活性。過表達OTUD3R79T能夠顯著延長PTEN半衰期，而過表達OTUD3E86K使PTEN半衰期顯著縮短。這一結果再次驗證了OTUD3R79T對PTEN蛋白穩(wěn)定性依然具有維持作用，但OTUD3E86K失去了正常功能，成為了PTEN水平的負向調控分子。OTUD3R79T和OTUD3E86K均可與細胞內

18、源PTEN發(fā)生相互作用，且作用強度與野生型OTUD3類似，證明OTUD3R79T和OTUD3E86K之間的功能差異和其與PTEN的相互作用無關而可能與其去泛素化酶活性的下降或喪失有關。
　　6.我們在50例乳腺癌樣本及相應的癌旁組織中篩查PTEN突變，發(fā)現(xiàn)了PTENF341V+I224M、PTENE307K和PTENF341V3個種PTEN蛋白的突變體。其中PTENF341V失去與OTUD3結合的能力，其蛋白穩(wěn)定性不能被OTUD3

19、調控，蛋白半衰期縮短;而PTEN1224M和PTENE307K突變蛋白首次被發(fā)現(xiàn)，二者均能與OTUD3發(fā)生相互作用，且結合能力與野生型PTEN無明顯差異。OTUD3能夠維持二者的蛋白穩(wěn)定性，過表達OTUD3能夠使二者的半衰期顯著延長。上述結果表明PTEN氨基酸序列的I224和E307位點不參與介導PTEN與OTUD3的結合和OTUD3對PTEN的穩(wěn)定性維持。
　　7.我們的研究證明了CHIP通過促進PTEN的泛素-蛋白酶體途徑降解

20、使細胞內PTEN蛋白水平下降，PI3K-Akt被過度激活，高度活化的Akt促進了下游FoxO家族分子的磷酸化。被磷酸化修飾的FoxO家族分子活性受到抑制，降解增加。其中的FoxO3分子作為多個基因轉錄調控的重要分子，被過度磷酸化修飾后與bim基因啟動子及pten基因的啟動子區(qū)域結合能力均下降，使得bim和pten基因的轉錄受到抑制，從而導致Bim蛋白和PTEN蛋白的合成減少。其中Bim蛋白水平的下降能夠使細胞凋亡受到抑制，細胞產(chǎn)生凋亡抑

21、制現(xiàn)象，即細胞對化療藥物誘導的細胞凋亡敏感性降低。而PTEN蛋白合成減少會進一步使PTEN蛋白水平下降，從而致使細胞內Akt的磷酸化水平進一步升高，F(xiàn)oxO3分子磷酸化比例進一步增加，pten基因轉錄受到更嚴重的抑制，從而形成了一個使PTEN蛋白水平不斷下降的正反饋環(huán)路。即CHIP通過在轉錄水平和翻譯后修飾水平對PTEN進行雙重機制的調節(jié)，這兩種調節(jié)機制使得細胞內PTEN水平不斷下降，而這一正反饋的形成最終致使乳腺癌細胞MCF7和乳腺上

22、皮細胞MCF10A對化療藥物誘導的細胞凋亡的敏感性均顯著下降。對腫瘤組織的檢測亦證實在乳腺癌組織中確實存在CHIP高表達的現(xiàn)象，且組織中CHIP的表達水平與PTEN和Bim的表達水平成反比。
　　結論
　　1.OTUD3是PTEN的去泛素化酶，能夠維持PTEN蛋白的穩(wěn)定性。
　　2.OTUD3通過對PTEN穩(wěn)定性的調控發(fā)揮其抑癌功能。
　　3.乳腺癌組織中存在影響OTUD3功能的基因突變。
　　4.泛素連接