組蛋白去泛素化酶USP22在睪丸中調(diào)控AR活性的機制研究.pdf

1、目的:男性不育是指有正常夫妻生活1年以上，未實施避孕措施，由于男方因素導致女方未能受孕的一類疾病，其發(fā)病率呈上升趨勢。世界衛(wèi)生組織(WHO)認為影響人類正常生活及健康的疾病中，不孕不育的關(guān)注度將僅次于腫瘤和心腦血管病。然而，男性不育癥的發(fā)病原因和發(fā)生的分子機制尚不十分清楚。AR屬于核受體超家族中的類固醇激素受體，是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子。雄激素及雄激素受體(Androgen receptor，AR)在精子發(fā)生和男性不育中起到重要性作用。

2、雄激素對于促進睪丸發(fā)育，維持睪丸功能，促進男性第二性征成熟，保持骨骼肌肉系統(tǒng)男性化，維持性欲以及啟動精子發(fā)生均必不可少。雄激素通過與AR相結(jié)合在不同靶器官中發(fā)揮不同的生物學功能。USP22是一種組蛋白去泛素化水解酶，研究證實USP22在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用，在前列腺癌中的研究提示，USP22作為AR的輔激活因子，參與上調(diào)AR介導的基因轉(zhuǎn)錄，通過對AR修飾維持AR的穩(wěn)定性，并促進前列腺癌的增殖。然而USP22在睪丸中是否表達并發(fā)揮其生物

3、學功能，對AR基因介導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用如何目前尚不明確。本研究中我們從睪丸來源的不同種類的細胞系，雄性小鼠睪丸組織，人正常睪丸組織，人的精漿這四個方向展開相關(guān)研究，探究USP22在睪丸中如何調(diào)控AR活性，并將進一步解析USP22在睪丸中調(diào)控AR的分子機制，試圖為臨床上與雄激素分泌異常等男性不育患者提供治療新思路。
　　方法:1.AR和USP22的表達。1.1 Western Blot實驗檢測4種睪丸來源細胞系（間質(zhì)細胞，支持細胞）中

4、AR和USP22的表達。1.2 Western Blot實驗檢測小鼠各部位組織中AR和USP22的表達。1.3 Western Blot實驗檢測雄性小鼠不同發(fā)育時期的睪丸組織中AR和USP22的表達。2.USP22對AR介導的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過Luciferase assay實驗在DHT添加或不加的情況下，在睪丸間質(zhì)細胞（R2C細胞）中外轉(zhuǎn)USP22質(zhì)粒及AR基因轉(zhuǎn)錄實驗體系的基因表達質(zhì)粒和報告質(zhì)粒。3.利用高通量測序RNA-seq技術(shù)

5、檢測在敲低USP22的條件下，在全基因組水平上檢測USP22對AR調(diào)控基因表達的影響，解析USP22對AR功能的影響。4.已知的AR下游靶基因Cyp17A1和DdX25的表達。4.1 Western Blot實驗檢測4種睪丸來源細胞系中Cyp17A1和DdX25的表達。4.2 Western Blot實驗檢測雄性小鼠不同發(fā)育時期的睪丸組織中Cyp17A1和DdX25的蛋白表達。4.3Real time-PCR實驗檢測雄性小鼠不同發(fā)育時期

6、的睪丸組織中Cyp17A1和DdX25的mRNA表達。5.免疫組化實驗觀察USP22，ub-H2A，ub-H2B在人類正常睪丸組織切片中的定位。6.Western Blot實驗檢測AR和USP22在52例正?；蚰行圆挥颊呔珴{中的蛋白表達水平及兩者表達量的相關(guān)性分析。7.通過siRNA敲低內(nèi)源性USP22，在DHT添加或不加的影響下，Western Blot實驗觀察USP22對AR蛋白表達量的影響。
　　結(jié)果:1.USP22在4種

7、細胞系中均有表達;而AR的表達卻各有不同，間質(zhì)細胞來源的R2C表達較強，TM3表達為陰性，支持細胞來源的TM4和15P-1表達為弱陽性;USP22在成熟小鼠睪丸中有表達。2.在DHT存在條件下，USP22參與上調(diào)AR介導的基因轉(zhuǎn)錄。3.在AR陽性細胞中，高通量測序RNA-seq技術(shù)在全基因組水平上檢測了USP22對AR功能的影響。USP22的缺失影響了一系列與AR相關(guān)基因的表達，其中包括與激素合成相關(guān)的基因。4.已知AR下游靶基因Cyp

8、17A1和DdX25在睪丸細胞及睪丸組織中均有表達。5.人來源的睪丸組織病理切片的免疫組化結(jié)果顯示USP22定位于人正常睪丸組織Leydig細胞和Sertoli細胞的細胞核中。6.在52例正常或男性不育患者精漿中進行Western Blot實驗，結(jié)果顯示AR與USP22的表達量呈正相關(guān)，而USP22在精漿中的表達與男性不育的程度未見明顯相關(guān)性。7.在R2C細胞中，USP22缺失時，AR的表達量也隨之減少，提示USP22在睪丸細胞中可能參