泛素行異性蛋白酶USP26突變型去泛素化酶活性檢測.pdf

1、目的:泛素特異性蛋白酶(ubiquitin specific protease，usp)26基因位于X染色體q26.2區(qū)域，基因編碼區(qū)由一個外顯子構成，含2794個堿基，編碼913個氨基酸，推測其蛋白質分子量約104KDa。Usp26基因屬于去泛素化酶家族(deubiquitinating enzymes，DUBs)，去泛素化酶在泛素蛋白酶體途徑發(fā)揮多個作用，包括多聚泛素鏈的分離，將被泛素化的蛋白上的泛素去除以避免蛋白被降解，以及去除泛

2、素殘基促進蛋白酶體的降解作用和泛素的再利用，進而調節(jié)蛋白的活性或其降解。Usp26由wang等首次報道，分離自小鼠精原細胞。在人和小鼠中，usp26在睪丸組織特異性表達。但是目前對于usp26基因的生理機制和分子途徑并不十分清楚。最近有一些研究指出，usp26基因多態(tài)性可能與男性不育相關。DiracAM等的研究提示USP26在雄激素受體信號傳導途徑中的作用可能與其去泛素化酶活性有關。因此，我們通過檢測usp26種突變型的去泛素酶活性變化

3、，研究usp26基因的幾種突變型對其去泛素化活性的影響，為usp26的分子途徑和生理功能提供線索，同時為研究usp26基因與男性不育癥的關聯(lián)性研究奠定基礎。
　　 方法:
　　 1、質粒的構建。野生型usp26基因由荷蘭研究者AnnetteM.G.Dirac提供。利用野生型usp26基因為模版，進行PCR擴增，引入BamHI酶切位點，以便后續(xù)構建質粒。引物序列:上游引物為5'-GGATCCATGGCTGCCCTATTCC

4、TAC-3'，下游引物為5'-GGATCCTTATTCCTTCTGAAGGGTCTCC-3'。PCR產物純化回收后進行BamHI位點酶切反應，連接到pGEX-6p-1中。構建的質粒pGEX-usp26最后進行測序鑒定。將pET-3d質粒的T7啟動子以BglⅡ和HindⅢ酶切位點切下，與BamHI及HindⅢ處理的pACYC184質粒進行連接，確保T7啟動子處于閱讀編碼框內。將已構建的pGEX-usp26中的usp26基因以BamHI酶切

5、位點切下，連入pAC-T7中。將構建的pAC-T7-usp26質粒進行測序鑒定。
　　 2、定點突變。利用定點突變的方法構建5個SNP:468G＞T、1274C＞T、2144A＞T、2204T＞G、2239A＞T突變型及CS無活性突變型911G＞C。分別以特異性引物進行定點突變PCR反應，反應條件95℃預變性30sec，95℃變性30sec，55℃復性1min，68℃延伸10min，18次循環(huán)，最后72℃延伸5min。
　

6、　 3、去泛素化酶活性分析。采用模型底物GST-Ub52及Ub-Met-β-gal進行去泛素化酶活性分析。質粒pACYC-usp46和pAC-T7分別作為陽性對照和陰性對照。將pAC-T7-usp26野生型、pAC-T7-usp26突變型、pACYC-usp46及pAC-T7分別與pGEX-Ub52共轉化入BL21細菌中，IPTG誘導蛋白表達。細菌超市破碎后，將底物GST融合蛋白用GSH-SepharoseResin純化后，10％SD

7、SPAGE電泳檢測。另一模型底物Ub-Met-β-gal檢測體系，采用pGEX-usp46和pGEX-6p-1分別作為陽性和陰性對照。pGEX-usp26野生型、pGEX-usp26突變型、pGEX-usp46及pGEX-6p-1分別與與pAC-M-β-gal共表達與BL21細菌中，IPTG誘導表達后，采用小鼠β-gal抗體及兔抗小鼠熒光抗體進行蛋白質印跡分析。采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進行結果收集。
　　 結果:<

8、br>　　 1、定點突變:對測序結果進行序列分析證實定點突變成功突變位點468G＞T,1274C＞T,2144A＞T,2204T＞G,2239A＞T及911G＞C。
　　 2、USP26具有去泛素化酶活性:為檢測USP26去泛素化酶活性，將其分別與模型底物GST-Ub52及Ub-Met-β-gal共表達與BL21細菌中。USP46與GST-Ub52共表達后，GST-Ub52被去泛素化，產生分子量約36KDa的產物。野生型USP

9、26與USP46一樣具有去泛素化酶活性，其活性較之USP46更為顯著。與預期一致，USP26CS突變型失去去泛素化酶活性。用模型底物Ub-Met-β-gal進行去泛素化酶活性分析發(fā)現(xiàn)，結果與GST-Ub52模型底物的分析一致。
　　 3、USP26的5個SNP活性檢測:為檢測USP26468G＞T，1274C＞T，2144A＞T，2204T＞G及2239A＞T突變去泛素化酶的活性，將各個突變質粒分別與模型底物GST-Ub52及U

10、b-Met-β-gal共表達于BL21細菌中。與GST-Ub52共表達后，468G＞T，1274C＞T，2144A＞T，2204T＞G及2239A＞T突變株，與野生型一樣，GST-Ub52被去泛素化，產生分子量約36KDa的產物。用模型底物Ub-Met-β-gal進行去泛素化酶活性分析的結果與GST-Ub52模型底物的分析一致，總之，此5種突變型未影響USP26的去泛素化酶活性。
　　 結論:
　　 1、通過定點突變PC

11、R，成功突變usp26基因5種SNP突變位點。
　　 2、GST-Ub52及Ub-Met-β-gal模型底物檢測去泛素化酶活性體系可有效檢測USP26的去泛素化活性。
　　 3、野生型USP26具有顯著的去泛素化酶活性。當USP26活性關鍵位點第304位半胱氨酸被絲氨酸取代后，USP26失去去泛素化酶活性。
　　 4、Usp26基因的五個SNP:468G＞T、1274C＞T、2144A＞T、2204T＞G、223