核蛋白STIP介導去泛素化酶USP7分子調控的機制研究.pdf

1、STIP是一種核磷酸化蛋白，過表達時在核中能自我聚集成rod樣的大分子結構——stiposome。STIP在人體內的多個器官，如腎，肝，肺等，以及各個發(fā)育階段均有表達，且從線蟲到人高度同源，它的表達受到干擾后，會使胚胎發(fā)育停止在16細胞階段，說明STIP在生物進化中具有非常重要的保守功能。然而，至今STIP在細胞內的功能和作用機制仍然知之甚少。
　　USP7屬于半胱氨酸蛋白酶，是泛素特異性蛋白酶家族的重要成員之一，是首個被確認的p

2、53底物特異性去泛素化蛋白酶。USP7可以直接結合并去泛素化p53，穩(wěn)定p53。同時，USP7還能結合并去泛素化p53的負調控子E3泛素連接酶Mdm2，穩(wěn)定Mdm2。結構和生化研究揭示Mdm2與USP7的親和力明顯高于p53數(shù)倍，是USP7在非應激的條件下優(yōu)先結合的底物。此外，USP7還能調節(jié)細胞內眾多蛋白底物的活性和功能，包括抑瘤蛋白、DNA修復蛋白、免疫應答蛋白、病毒蛋白、表觀遺傳調節(jié)子等，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

3、　　前期研究我們發(fā)現(xiàn)STIP通過減少Mdm2和p53的泛素化，延長Mdm2和p53蛋白的半衰期，導致Mdm2和p53蛋白的穩(wěn)定，并促進腫瘤細胞的生長。由于STIP并不具有任何酶的活性和功能，為了揭示其介導Mdm2和p53穩(wěn)定的分子機制，我們首先通過生物信息學的方法，分析了STIP的蛋白序列上可能結合的蛋白，發(fā)現(xiàn)STIP蛋白序列上有多個去泛素化酶USP7的結合位點，提示STIP與USP7很可能在細胞內發(fā)生相互作用。為了驗證預測結果，我們采

4、用激光共聚焦顯微鏡，通過間接免疫熒光的方法，發(fā)現(xiàn)內源性STIP與USP7共定位于細胞核內stiposome。進一步通過免疫共沉淀實驗和GSTp(μ)ll-down實驗，明確STIP與USP7在細胞內直接相互作用。為了揭示STIP結合于USP7的部位，我們將不同刪除區(qū)段的USP7質粒在細胞中表達，通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，USP7的N端和C端介導了與STIP的結合。USP7作為去泛素化酶不僅能去泛素化并穩(wěn)定p53，而且也能去泛素化并穩(wěn)定它的

5、負調控子Mdm2，為了明確STIP是否通過USP7來調控Mdm2和p53的穩(wěn)定，我們分別通過過表達USP7、干擾USP7的表達以及突變USP7的酶活性功能區(qū)等策略，證明STIP穩(wěn)定Mdm2和p53依賴于USP7去泛素化酶的活性和功能。本文通過上述研究，揭示了STIP穩(wěn)定Mdm2和P53的分子機制，明確了STIP是介導USP7對Mdm2和p53調控的新分子，不僅有助于豐富Mdm2-p53通路分子調控的理論，而且為進一步探討STIP在腫瘤中