ROS-AMPK介導的凋亡通路在川芎嗪抗胃癌作用中的機制研究.pdf

1、胃癌是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤，整體預后不佳，化療是其主要治療手段之一。但是，現(xiàn)有的化療藥物存在著副作用大、化療耐藥等諸多問題，因此，從天然藥物中尋找有效的胃癌輔助治療藥物，可為胃癌治療提供新的途徑。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMPZ)是從川芎中提取的一種生物堿單體，其傳統(tǒng)治療作用主要表現(xiàn)為改善微循環(huán)、抗氧化應激方面。近些年來，川芎嗪在抗腫瘤治療方面逐漸成為國內(nèi)學者研究的熱點，并有研究指出川芎嗪能逆轉(zhuǎn)胃癌細胞多藥

2、耐藥，但是，川芎嗪是否本身有抗胃癌作用，其機制又是什么，迄今為止，并無研究報道。
　　AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是細胞內(nèi)的“能量調(diào)節(jié)器”，AMPK在能量缺乏時被激活，能量過量時抑制，其激活后能抑制細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪酸、多糖的合成，這些過程為腫瘤細胞增殖、發(fā)展所必須。并且我們在對臨床標本的檢測中發(fā)現(xiàn)，AMPK的活性狀態(tài)磷酸化AMPK(phosph-AMPK)的表達在胃癌

3、組織中幾乎檢測不到或僅微弱表達。那么，川芎嗪是否可以通過激活AMPK來達到抑制胃癌生長的目的呢？目前為止，尚無任何文獻報道。
　　本課題以SGC7901胃癌細胞為研究對象，研究TMPZ在不同藥物濃度、不同時間點對SGC7901胃癌細胞生長情況、凋亡的影響。在明確TMPZ可抑制胃癌細胞生長、促進細胞凋亡的基礎(chǔ)上，從ROS/AMPK信號通路途徑對TMPZ抗胃癌作用機制進行探討，現(xiàn)將本論文主要研究結(jié)果歸納如下:
　　1.收集病理確

4、認的胃癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜組織，免疫組化檢測磷酸化AMPK(p-AMPK)的表達情況。結(jié)果顯示，p-AMPK在正常組織中94％陽性表達，其陽性表達率高于癌旁組織72％(36/50)及胃癌組織4％(2/50)，而癌旁組織中p-AMPK蛋白表達顯著高于胃癌組織。進一步的Western blot結(jié)果顯示p-AMPK蛋白表達量在正常組織為0.93±0.14、癌旁組織為0.43±0.08，胃癌組織為0.07±0.01，差異有顯著性(P＜0

5、.05);
　　2.探討了TMPZ對SGC7901胃癌細胞的量效、時效關(guān)系。以不同濃度梯度的TMPZ(0，0.5，1，2，4，6，8mM)處理6，12，24，48 h以后，噻唑藍(MTT)比色法觀察SGC7901細胞的生長情況。不同濃度梯度的TMPZ作用于SGC7901胃癌細胞24 h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度的TMPZ對胃癌細胞生長無明顯影響，較高濃度的TMPZ(4，6，8 mM)在24h開始明顯抑制胃癌細

6、胞生長;并且，在TMPZ處理24h后明顯誘導腫瘤細胞的凋亡，其作用呈一定的濃度依賴性;同時我們進一步證實，較高濃度的TMPZ對人胃黏膜上皮細胞GES-1、人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECs、心肌樣細胞H9c2的細胞凋亡并不產(chǎn)生明顯影響;
　　3.針對高濃度的TMPZ呈劑量依賴性地誘導腫瘤細胞凋亡，流式細胞儀檢測高濃度TMPZ對ROS生成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度的TMPZ呈濃度依賴性地升高腫瘤細胞ROS的含量，并且抑制細胞生長;給予ROS

7、清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)之后，ROS含量明顯下降，并且高濃度的TMPZ不再能抑制腫瘤細胞的生長;
　　4.Western blot法檢測高濃度的TMPZ對胃癌SGC7901細胞AMPK磷酸化激活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度的TMPZ呈劑量依賴性地激活AMPK，使AMPK磷酸化水平增多，但是給予NAC之后，高濃度TMPZ所誘導的AMPK的磷酸化激活被取消;
　　5.使用AMPK特異性的阻斷劑Compound C，深入探討高濃

8、度TMPZ通過ROS/AMPK信號通路介導通過線粒體凋亡途徑。結(jié)果表明，TMPZ通過激活AMPK，促使Bax從胞漿向線粒體遷移，使線粒體膜電位崩解，細胞色素C(cytochromec，Cyt c)從線粒體釋放至胞漿中，然后激活caspase-9、caspase-3，從而導致胃癌SGC7901細胞凋亡。
　　綜上所述，從臨床胃癌組織標本中AMPK活性被顯著抑制這一現(xiàn)象得到啟發(fā)，對TMPZ抗胃癌細胞SGC7901作用及機制進行研究發(fā)現(xiàn)