川芎嗪對周圍神經(jīng)及其在體外儲存過程中的保護作用.pdf

1、第一部分、川芎嗪對雪旺細(xì)胞合成與分泌神經(jīng)生長因子及其耐缺血缺氧損傷的影響
　　目的:
　　(1)觀察川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)對體外培養(yǎng)的SD乳鼠雪旺細(xì)胞合成與分泌神經(jīng)生長因子(NGF)的影響，探討TMP促進周圍神經(jīng)損傷修復(fù)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用的可能機制;
　　(2)構(gòu)建SD乳鼠雪旺細(xì)胞體外缺血缺氧損傷模型，探討TMP對雪旺細(xì)胞缺血缺氧損傷的保護作用及其機制;旨在為TMP作為周圍神經(jīng)保護劑和

2、周圍神經(jīng)體外保存液添加劑提供細(xì)胞生物學(xué)理論依據(jù)。
　　方法:
　　(1)分離SD乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞進行原代培養(yǎng)，將第2代雪旺細(xì)胞行S-100免疫熒光鑒定后分為正常對照組(Normal control)、溶媒對照組（Vehicle control）和TMP組，其中溶媒對照組在FBS/DMEM培養(yǎng)基中加入0.1％ DMSO作為溶劑對照，TMP組則在FBS/DMEM培養(yǎng)基中分別加入工作濃度為25、50、100和200μ g/ml

3、的TMP。24h后采用MTT比色法和Annexin-FITC試劑盒評估TMP對雪旺細(xì)胞增殖和凋亡的影響，Quantitative real-time PCR與ELISA法分別于mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測TMP對雪旺細(xì)胞合成與分泌NGF的影響;
　　(2)分離SD乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞進行原代培養(yǎng)，將第2代雪旺細(xì)胞行S-100免疫熒光鑒定后分為缺血缺氧組（OGD組）、溶媒對照組(Vehiclecontrol)、TMP組和正常對照組(No

4、rmal control)。對缺血缺氧組、溶媒對照組和TMP組雪旺細(xì)胞采用OGD（oxygen glucose deprivation）法構(gòu)建體外缺血缺氧損傷模型，其中溶媒對照組在缺血缺氧造模前即刻給予0.1％ DMSO作為溶劑對照，TMP組則在造模前即刻分別加入工作濃度為25、50、100和200μg/ml的TMP，直至造模結(jié)束。正常對照組在常規(guī)條件下采用FBS/DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。通過MTT比色法、LIVE/DEAD Viabi

5、lity/Cytotoxicity試劑盒及測定培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)活性評估雪旺細(xì)胞活力和損傷情況，運用Annexin-FITC試劑盒檢測雪旺細(xì)胞凋亡程度，Quantitative real-time PCR和Westernblotting方法檢測凋亡相關(guān)因子Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)正常對照組、溶媒對照組和25、50μg/ml TMP組組間，NGF mRNA表達(dá)水平和培養(yǎng)

6、基上清中NGF含量均未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);100、200μ g/ml TMP組NGF mRNA表達(dá)水平及NGF含量均較正常對照組增高（均P＜0.05），但二組間未見明顯差異(P＞0.05)。
　　(2)與正常對照組比較，缺血缺氧組和溶媒對照組雪旺細(xì)胞活力均顯著降低，細(xì)胞死亡率、培養(yǎng)上清中LDH活力及細(xì)胞凋亡率均顯著增高（均P＜0.05），而抑凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，促凋亡基因Bax、Caspase

7、-3 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，且Caspase-3活化增強（均P＜0.05）;但缺血缺氧組與溶媒對照組組間相比，上述指標(biāo)均無明顯差異（均P＞0.05）;與缺血缺氧組比較，TMP呈一定濃度依賴性地升高缺血缺氧損傷雪旺細(xì)胞活力，減少細(xì)胞死亡率、LDH活性及細(xì)胞凋亡率，且TMP可顯著上調(diào)缺血缺氧雪旺細(xì)胞中Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平及抑制Caspase-3活化（均P＜0.05）。<

8、br>　　結(jié)論:
　　(1)TMP具有促進雪旺細(xì)胞合成與分泌NGF的生物學(xué)效應(yīng)，且該效應(yīng)呈濃度依賴性，這可能是其促進神經(jīng)損傷修復(fù)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制之一。
　　(2) TMP能夠濃度依賴性地對缺血缺氧損傷雪旺細(xì)胞發(fā)揮保護作用，且該作用與其調(diào)控凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)，這可能是TMP對周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護作用的又一相關(guān)機制。
　　第二部分、UW液4℃條件下保存周圍神經(jīng)

9、的實驗研究
　　目的:探討UW液低溫保存方法對大鼠坐骨神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活性及免疫原性的影響及其時限性。
　　方法:60只成年健康SD雄性大鼠，切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)（共120條），隨機分為4組，每組30條坐骨神經(jīng)。A組:新鮮對照組，不做任何處理以作為正常對照;B組:UW液保存1周組;C組:UW液保存4周組;D組:UW液保存6周組。B-D三組坐骨神經(jīng)組織均在4℃條件下分別保存1、4、6周。采用HE染色和透射電鏡掃描觀察神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)

10、改變;LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity試劑盒和TUNEL染色分別評估細(xì)胞活性和凋亡情況;Western blotting法檢測細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)的表達(dá)以了解免疫原性改變。
　　結(jié)果:與A組相比，B、C、D組神經(jīng)外膜和雪旺細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)均較完整，無明顯差別，但細(xì)胞活性程度降低，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)增多，ICAM-1和MHCⅡ表達(dá)降低，均有明顯統(tǒng)計學(xué)差

11、異（均P＜0.05）;與B組相比，C、D組細(xì)胞活性程度進一步減弱，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（均P＜0.05），ICAM-1和MHCⅡ表達(dá)顯著降低（均P＜0.05）;但C、D組組間相比均未見明顯差異（均P＞0.05）。
　　結(jié)論:UW液低溫保存方法能有效維持周圍神經(jīng)組織神經(jīng)外膜和雪旺細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)完整性，并降低保存神經(jīng)的免疫原性，但有效維持神經(jīng)組織細(xì)胞活性的時限不超過1周，一旦保存時限達(dá)到或超過4周，神經(jīng)組織中細(xì)胞活性幾乎喪失殆

12、盡。
　　第三部分、川芎嗪對UW液4℃條件下保存的周圍神經(jīng)組織細(xì)胞活性及凋亡的影響
　　目的:探討添加不同濃度的川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)對UW液低溫保存的大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞活性及凋亡的影響。
　　方法:49只成年健康SD雄性大鼠，切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)（共98條），隨機分為7組，每組14條坐骨神經(jīng)。A組:新鮮坐骨神經(jīng)，不做任何處理以作為正常對照;B組:UW液保存組;C組:UW液+0.1％ DMS

13、O保存組，0.1％ DMSO是作為溶劑對照;D組:UW液+100mg/ml TMP保存組;E組:UW液+200mg/ml TMP保存組;F組:UW液+300mg/mlTMP保存組;G組:UW液+400mg/ml TMP保存組。B-G六組坐骨神經(jīng)組織均在4℃條件下保存4周。采用透射電鏡掃描，LIVE/DEADViability/Cytotoxicity試劑盒染色觀察各組神經(jīng)組織超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活性改變，TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。<

14、br>　　結(jié)果:與A組比較，B-G六組坐骨神經(jīng)組織均有超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)損害表現(xiàn)，神經(jīng)組織細(xì)胞活性降低，且TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多（均P＜0.05）;B、C組組間均未見明顯差異;與B組相比，D組神經(jīng)組織病理學(xué)損害及細(xì)胞活性未見明顯差異，但TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)降低(P＜0.05)，E、F、G組三組則神經(jīng)組織病理學(xué)損害較輕，細(xì)胞活性較強，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低（均P＜0.05），且E、F、G組與D組相比，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)進一步降低