基于cDNA-aflp篩選茶樹被茶尺蠖取食誘導的相關(guān)差異基因及SAMT的克隆與表達分析.pdf

1、茶樹蟲害一直是我國茶葉高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的重要限制因子之一，而且茶樹被害蟲取食后所誘發(fā)的防御反應分子機制至今不清，研究尚處于起步階段。本研究通過cDNA-AFLP技術(shù)篩選茶樹葉片被茶尺蠖取食后差異表達基因的數(shù)量和種類，并運用qRT-PCR對相關(guān)差異基因進行驗證和表達規(guī)律分析，同時對茶樹SAMT進行cDNA全長克隆、原核表達及其被茶尺蠖取食誘導后、MeJA處理誘導后的表達特征分析。主要結(jié)果如下：
　　 (1)利用cDNA-AFLP技術(shù)分析

2、茶樹被茶尺蠖取食誘導前后的基因表達譜差異，試驗共挑取231條表達差異條帶(TDF)，通過驗證、測序后獲得134條(>80bp)EST序列，占挑取條帶總數(shù)的58％，且序列長度在80-700bp之間。其中，上調(diào)與下調(diào)TDF數(shù)分別為81和53條，各占獲得EST序列的60.4％與39.6％。
　　 (2)在GenBank中進行Blastx比對分析表明，獲得的TDF序列在已知功能上主要與基礎(chǔ)代謝相關(guān)，占總數(shù)的23.1％，其次與光合與能量，

3、以及蛋白質(zhì)合成與儲藏相關(guān)，分別占9.0％與8.2％，再者是與信號傳導相關(guān)，占6.7％，與抗病與防御相關(guān)的占4.5％，其它分別與轉(zhuǎn)錄因子、運輸、細胞生長與結(jié)構(gòu)相關(guān)的占1.5-3.0％；此外，還有6.7％的序列功能不明確，20.2％的沒有同源序列。這些序列已經(jīng)遞交到GenBank中，其登錄號為JK711037-JK711046、JK714343-JK714436和JK720971-JK721000。
　　 (3)qRT-PCR分析表

4、明，茶樹被茶尺蠖取食后3h，與p450(21F1)、乙烯響應因子(22D)、熱激蛋白(27L3)和MYB轉(zhuǎn)錄因子(28F)相關(guān)的TDF表達量皆大幅度上升，其中28F上升幅度最大，為對照的336.2倍，其次為22D，隨后依次為21F1和27L3；取食后6h均急劇降低，至48h時，除了27L3略高于對照外，其余都低于對照。
　　 (4)以差異片段26N序列為基礎(chǔ)，利用3’/5’-RACE技術(shù)從茶樹葉片中克隆了一條編碼SAMT的cDN

5、A全長，其長度為1542bp，開放閱讀框(ORF)1098bp，編碼365個氨基酸，并命名為CsSAMT(GenBank登錄號：JQ406919)，其編碼的SAMT理論分子量和等電點分別為41.7kD與5.39；同源比對發(fā)現(xiàn)其與金魚草的AmSAMT同源性最高，為53％，屬于甲基轉(zhuǎn)移酶-7超家族，具有SABATH甲基轉(zhuǎn)移酶類的共有性質(zhì)；蛋白質(zhì)保守功能結(jié)構(gòu)域預測分析表明，CsSA：MT含有甲基轉(zhuǎn)移酶-7超家族基因相應保守區(qū)，如一個保守的SA

6、M的結(jié)合位點結(jié)構(gòu)域I[(V/I/L)(L/V)(D/E)(V/I)G(G/C)G(T/P)G]，一個SA結(jié)合位點結(jié)構(gòu)域[SSYSVHWLS]等。
　　 (5)原核表達結(jié)果表明，CsSAMT表達的融合蛋白主要分布于包涵體中，分子量約為59kDa；經(jīng)過溫度和IPTG濃度條件進行優(yōu)化，以及表達載體的更換后，CsSAMT表達的融合蛋白仍然分布于包涵體中，且沒有測出其酶活性。
　　 (6)茶樹被茶尺蠖取食后3h，CsSAMT的表達