茶樹被茶尺蠖取食誘導(dǎo)的HPL基因克隆、功能鑒定與表達(dá)特征研究.pdf

1、C6 揮發(fā)物是植物對(duì)害蟲進(jìn)行間接防御的關(guān)鍵物質(zhì)之一，而植物體內(nèi)的脂氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）是其合成的關(guān)鍵酶。而有關(guān)茶樹HPL基因及其與害蟲取食間的關(guān)系至今未見報(bào)道。論文在本課題組前期建立的茶樹被茶尺蠖取食誘導(dǎo)前后的 cDNA消減雜交文庫（SSH）中獲得一條與 HPL 同源性很高的 EST（GenBank：GW342656）基礎(chǔ)上，對(duì)茶樹HPL基因進(jìn)行了 cDNA全長克隆、功能鑒定、及其被茶尺蠖取

2、食誘導(dǎo)的表達(dá)特征分析。主要結(jié)果如下：
　　 （1）利用 3’/5’RACE技術(shù)從茶樹葉片中克隆了一條編碼 HPL的 cDNA全長，其序列長度為 1662 bp，從起始密碼子開始有 5個(gè)開放閱讀框（ORF），其中最長的ORF 編碼含 491個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，并命名為 CsHPL（GenBank：HM440156），其理論分子量和 PI分別為 54.88kD和 8.02，多序列同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其與番石榴的13HPL（AF239670

3、）同源性最高，為 71％；蛋白質(zhì)保守功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析表明，CsHPL 含有細(xì)胞色素 P450 家族中高度保守的 4個(gè)結(jié)構(gòu)域 A、B、C和 D，且結(jié)構(gòu)域A（I 螺旋區(qū))中保守的蘇氨酸被異亮氨酸所代替，結(jié)構(gòu)域D中高度保守的半胱氨酸殘基附近有一些特殊的序列NKQAA；進(jìn)化樹分析表明，CsHPL與番石榴的13HPL等同在一起屬于CYP74B 亞類。（2）原核表達(dá)分析表明，CsHPL基因表達(dá)的蛋白分布于上清和包涵體中，結(jié)果產(chǎn)生了分子量約為60k

4、D；體外酶促反應(yīng)結(jié)果顯示，原核表達(dá)的CsHPL只催化13HPOT底物，而對(duì)9HPOT不表現(xiàn)活性，因此屬于13HPL類型；原核表達(dá)的CsHPL 最適溫度為25℃，最適pH 值為7.0。對(duì) CsHPL基因的 5個(gè)不同ORF(Met1，Met5，Met8，Met9和Met15)全部進(jìn)行了原核表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們各自表達(dá)的蛋白都具有HPL 活性。（3）利用GCMS對(duì)原核表達(dá)的CsHPL 催化產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明其將底物13HPOT催化生成的C

5、6 揮發(fā)物為(z)3己烯醛。（4）Southern blot分析表明，CsHPL基因以單拷貝存在與茶樹基因組中。（5）qRTPCR分析表明，兩個(gè)茶樹品種龍井43和舒茶早被茶尺蠖取食后39h，CsHPL基因表達(dá)量能夠明顯上升，且達(dá)到最大表達(dá)量，隨后下降，但是其最大表達(dá)量和出現(xiàn)的時(shí)間存在品種間差異；龍井43在取食后3 h CsHPL基因表達(dá)量上升至最大值，為對(duì)照的13.6 倍，而舒茶早則在9 h 時(shí)表達(dá)量最大，為對(duì)照的3.9 倍。對(duì)兩個(gè)品種