基于DDRT-PCR研究茶樹對茶尺蠖取食誘導(dǎo)的基因表達譜差異分析.pdf

1、茶葉作為飲品的特殊性，使化學(xué)農(nóng)藥和外源抗蟲基因的使用受到限制，這就給害蟲防治帶來很大困難。近年來，防治技術(shù)的確取得了很大進步，但茶樹蟲害仍屢屢成災(zāi)，農(nóng)藥殘留超標形勢依然嚴峻。因此，在茶樹抗蟲育種技術(shù)、抗蟲基因資源以及內(nèi)源抗蟲劑的發(fā)掘和綜合防治理論上要有新的突破。 基因表達譜差異顯示技術(shù)是最近興起的研究同種細胞在不同狀態(tài)下基因表達差異的一種有效手段。目前已成功應(yīng)用于植物對害蟲取食誘導(dǎo)防御的分子機制和發(fā)掘植物內(nèi)源抗蟲基因的研究領(lǐng)域，

2、并顯示出獨特的優(yōu)勢。本研究針對我國茶葉生產(chǎn)現(xiàn)實中長期面臨的嚴峻問題，以茶樹中的農(nóng)抗早品種為研究對象，通過DDRT-PCR方法研究同一茶樹品種葉片被茶尺蠖取食前后，基因表達譜的差異表現(xiàn)特征，并結(jié)合RT-PCR對差異表達的基因進行鑒定，以生物信息學(xué)手段對差異表達基因進行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測。并對與抗性有關(guān)的基因序列，用cDNA末端陜速擴增(RACE)技術(shù)克隆其全長cDNA序列進行序列分析。希望能夠揭示茶樹對茶尺蠖取食誘導(dǎo)防御的相關(guān)分子機制，通

3、過研究取得了如下結(jié)果： 1.對處理組和對照組葉片進行九對引物組合的差異顯示分析，處理組合對照組的葉片之間存在表達差異。 利用引物A3、A4、A7和A8分別與隨機引物R1-R8，R12組合擴增后，總共得到222條差異條帶，占總條帶數(shù)的32.8％。在所鑒定的20個差異片段中，有8個片段序列沒有發(fā)現(xiàn)同源序列；有5個片段序列與未知功能蛋白相關(guān)；其余7個差異表達的片段序列可分為6類，即分別與光合系統(tǒng)Ⅱ色素蛋白(C15)、非生物抗性

4、誘導(dǎo)蛋白(D22)、糖苷代謝酶(A45)、核酸和蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(A12，D63)、生長素調(diào)節(jié)蛋白(E94)和營養(yǎng)性抗蟲蛋白相關(guān)(D73)。其中差異表達片段C15、A45、D22、D73和E94在植物與害蟲相互作用相關(guān)分子機制研究中首次被發(fā)現(xiàn)。 2.糖苷代謝酶和非生物抗性誘導(dǎo)蛋白與抗蟲性相關(guān)，所以利用RACE技術(shù)得到了A45和D22cDNA全長。A45 cDNA的全長序列為2495 bp，序列的5’端和3’端非編碼區(qū)序列長度分別

5、為 72bp和120 bp，開放閱讀框編碼767個氨基酸。D22 cDNA的全長序列為2318 bp，序列的5’端和3’端非編碼區(qū)序列長度分別為128bp和157 bp，開放閱讀框編碼677個氨基酸。其中A45所編碼的是木糖苷酶，與草莓中的有很高的同源性。木糖苷酶可以參與分步水解B-櫻草糖苷，生成揮發(fā)性苷元，從而對茶樹葉部病蟲害產(chǎn)生抗性<'[70]>。而這些揮發(fā)性苷元同時也是茶園中茶樹－害蟲－天敵間的化學(xué)通訊物質(zhì)，糖苷類香氣前體常常能夠