水稻應(yīng)答稻縱卷葉螟取食和MeJA處理的基因差異表達(dá)分析與驗證.pdf

1、本研究利用cDNA-AFLP技術(shù)、消減文庫的構(gòu)建進(jìn)行水稻應(yīng)答稻縱卷葉螟取食的基因表達(dá)譜或基因差異展示研究，并利用實時熒光定量PCR．技術(shù)對部分重要候選基因差異表達(dá)進(jìn)行驗證，選取一個重要的候選基因構(gòu)建了其超表達(dá)載體，主要研究結(jié)果如下： 1、水稻應(yīng)答稻縱卷葉螟取食和MeJA處理轉(zhuǎn)錄譜的cDNA-AFLP分析。 使用16對引物組合對應(yīng)答稻縱卷葉螟取食和MeJA處理的水稻進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜的cDNA-AFLP分析，共獲得約12000 T

2、DFs。選取差異明顯的240條TDFs測序，197個找到對應(yīng)的基因序列。得到164個不重復(fù)的差異TDFs，其中，154個TDFs在稻縱卷葉螟取食作用下表達(dá)發(fā)生改變，94個發(fā)生上調(diào)，它們對應(yīng)的基因主要有生長素輸出載體家族蛋白、伴侶蛋白、早期應(yīng)答脫水蛋白、PHD鋅指蛋白等，60個發(fā)生下調(diào)，它們對應(yīng)的主要基因有RNA聚合酶bern亞基2、類枯草桿菌蛋白酶、熱激蛋白等；119個TDFs在外源MeJA作用下表達(dá)發(fā)生改變，其中70個TDFs發(fā)生上調(diào)

3、，它們對應(yīng)的基因主要有RNA聚合酶beta亞基2、PHD鋅指蛋白、病程相關(guān)蛋白5前體、NB-ARC結(jié)構(gòu)域蛋白、鐵氧還蛋白以及早期應(yīng)答脫水蛋白等，49個發(fā)生下調(diào)，它們對應(yīng)的基因主要有生長素輸出載體家族蛋白、熱激蛋白等。在水稻葉片接種稻縱卷葉螟幼蟲2h后，就發(fā)現(xiàn)68個差異表達(dá)的TDF，對應(yīng)的是水稻早期應(yīng)答稻縱卷葉螟取食的基因。在稻縱卷葉螟取食和外源MeJA作用下，發(fā)現(xiàn)水稻葉片中有42個TDFs共同上調(diào)，它們主要有PHD鋅指蛋白、生長素抑制蛋

4、白、早期應(yīng)答脫水蛋白等，12個TDFs共同下調(diào)，它們主要有類脯氨酰羧肽酶蛋白、核酮糖磷酸鹽羧化酶主鏈蛋白前體、熱激蛋白等。 2、構(gòu)建了水稻響應(yīng)稻縱卷葉螟取食的抑制消減文庫。SSH文庫是一種簡便而高效的差異表達(dá)基因篩選技術(shù)，該技術(shù)通過兩輪差減雜交和兩次抑制性PCR，使差異表達(dá)基因得到有效的富集并得以克隆，在分離克隆差異表達(dá)基因的應(yīng)用上表現(xiàn)出了獨特的優(yōu)越性。從中挑取135個克隆進(jìn)行PCR擴增并測序，得到33個不重復(fù)的差異表達(dá)基因的c

5、DNA克隆，其中有13個cDNA克隆與cDNA-AFLP的結(jié)果相一致，如生長素抑制蛋白、丙胺酸轉(zhuǎn)移酶、光誘導(dǎo)蛋白及NAC轉(zhuǎn)錄因子等。 3、應(yīng)用熒光定量技術(shù)對水稻應(yīng)答稻縱卷葉螟取食的4個TDFs對應(yīng)的基因表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，與TDF501對應(yīng)的PP2C基因、與TDF518對應(yīng)的膜關(guān)聯(lián)鹽脅迫蛋白基因和與TDF974對應(yīng)的PHD鋅指蛋白基因等在稻縱卷葉螟取食2h后開始表達(dá)，6h大量表達(dá)，隨后稍有減弱，這三個基因在MeJA處理后表達(dá)