基于cDNA-AFLP技術(shù)的與紅花品質(zhì)相關(guān)基因的篩選及克隆.pdf

1、紅花(Carthmus tinctorius L.)為菊科植物紅花的干燥管狀花,具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗凝、降血壓、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用,臨床應(yīng)用廣泛。其中黃酮類查爾酮成分-羥基紅花黃色素A(HSYA)是紅花的主要活性成分,而羥基紅花黃色素A含量的高低,直接影響紅花品質(zhì)的優(yōu)劣。對(duì)紅花品質(zhì)相關(guān)功能基因進(jìn)行研究,對(duì)提高紅花的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。 本研究采用HPLC法,對(duì)紅花親本及雜交F1及F2代植株的羥基紅花黃色素A含量進(jìn)行綜合分

2、析的結(jié)果表明,F1代各植株均含羥基紅花黃色素A,卡方檢驗(yàn)得F2代各植株含HSYA不含HSYA的比例為3:1(x2=1.36(x20.05=3.84,x2

3、數(shù)為10倍；選擇性擴(kuò)增最佳稀釋倍數(shù)為150倍；PAGE電泳得到清晰,穩(wěn)定、分辨率較高的多態(tài)性條帶。繼而采用紅花采用分群分類策略(BSA),以F2代含羥基紅花黃色素A與不含羥基紅花黃色素A的極端值為依據(jù),構(gòu)建了品質(zhì)性狀的兩個(gè)近等基因池。應(yīng)用cDNA-AFLP差異表達(dá)分析技術(shù),從表達(dá)水平篩選與羥基紅花黃色素A相關(guān)的基因片段(TDF)。在基因池中反復(fù)篩選,從256對(duì)引物中得到條帶多且清晰的適合紅花的132對(duì)引物組合。經(jīng)過基因池、親本及F2代單

4、株的共同驗(yàn)證,篩選出具有特異性多態(tài)性的兩組引物(EcoRI-CA/MseI-GA、EcoRI-TT/MseI-TC),最終獲得3條與紅花高品質(zhì)性狀(含HSYA)緊密連鎖的特異性TDF片段,分別命名為TDF-8、TDF-9、TDF-27,他們的遺傳距離為9.2 cM、6.8 cM、8.0 cM。經(jīng)測(cè)序,這3條片段的精確長(zhǎng)度分別為450bp、118bp、282bp,GenBank登陸號(hào)依次為EU567303,EU567305和Eu56730

5、4。3條片段的RT-PCR表達(dá)分析驗(yàn)證了cDNA-AFLP的準(zhǔn)確性。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),這3條基因片段與蠶豆萎蔫病毒和綠葉刺蕊草花葉病毒基因高度同源(>85％),推測(cè)羥基紅花黃色素A可能是由于外界病毒對(duì)紅花的侵染引發(fā)應(yīng)激作用以抵御病毒而產(chǎn)生抗性的結(jié)果,該病毒基因插入并整合到含羥基紅花黃色素A的紅花品種基因組,世代演化并穩(wěn)定遺傳下來。從進(jìn)化理論進(jìn)一步支持了本研究獲得的3條特異性TDF片段與羥基紅花黃色素A的產(chǎn)生密切相關(guān)的研究結(jié)果。本研究成