cDNA-AFLP分析大豆與尖孢鐮刀菌互作中基因表達圖譜.pdf

1、大豆根腐病(Soybeanrootrot)是一種分布廣、危害嚴重和防治較困難的世界性病害。近年來隨著大豆面積的不斷增加，大豆重迎茬狀況日益加劇，使大豆根腐病的危害逐年加重，對產量的影響越來越大。尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是大豆根腐病的主要致病菌。關于大豆根腐病的研究多集中于病理學方面，大豆與尖孢鐮刀菌互作分子機制未見報道，但是理解二者間的分子互作機制有助于對大豆根腐病的研究和防治。本試驗就是從轉錄水平研究大豆與尖孢

2、鐮刀菌的互作機理。 本文以cDNA-AFLP技術研究大豆與尖孢鐮刀菌親和性互作中大豆的轉錄圖譜。用浸根法接種尖孢鐮刀菌于大豆根部，以未接種的大豆根作為對照。分別在互作0d、2d、4d和8d后剪取接種和未接種的大豆根，然后提取大豆根部總RNA和mRNA，并將其反轉錄成cDNA后進行AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)分析。cDNA-AFLP操作中選擇識別6個堿基位點的AseI和識別4個

3、堿基位點的TaqI對雙鏈cDNA進行限制性酶切，得到的兩種粘末端分別連接上兩種人工接頭，預擴增一次后再用64對2+2選擇性引物擴增并在聚丙烯酰胺凝膠電泳后用銀染方法染色進行指紋圖譜分析。 結果表明：凝膠電泳顯示的條帶可分為4類：①在整個侵染過程中一直存在，而且未接種植物中也存在，這些片段是來自于植物。②一些片段在接種0-4d內處理均出現(xiàn)，在接種后8d表達量下降或不表達，而在對照中一直表達；還有一些在接種0天的處理中出現(xiàn)，在接種2

4、-8d內表達量下降或不表達，而在對照中一直表達，這些片段可能是來自于植物。③一部分片段在接種0d的RNA樣品中存在，在接種2-4d后消失，然后又開始積累，這些片段可能來自于尖孢鐮刀菌；還有一部分條帶只有在侵染后期才出現(xiàn)，這些片段大部分可能來自于病原菌，還有一些是來自于植物。這些來源于植物的基因一部分可能是由于受到尖孢鐮刀菌的侵染而被誘導表達。④大豆在被尖孢鐮刀菌侵染過程中沒有出現(xiàn)，而在對照中出現(xiàn)的條帶。這些基因可能是因為尖孢鐮刀菌產生抑

5、制子而抑制其表達。 經分析后共獲得差異片段16條，其中屬于上調的有9條，下調的有7條。16條差異片段均送到生物公司測序。8條片段在數(shù)據(jù)庫中找到同源序列，其中6條是已知功能的基因片段，其余的10條功能未知。序列同源性分析表明：S-7與大豆種衣BURP區(qū)域蛋白1基因有84％同源性；S-5與編碼菜豆鈣調素結合蛋白的基因有86％的同源性；S-19與白羽扇豆羥基多花堿-羥基烷寧轉移酶有80％同源性，對S-5進行克隆并獲得重組質粒。