cDNA-AFLP和CAPS技術(shù)分離瓣化型胡蘿卜雄性不育相關(guān)基因.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CytoplasmicMaleSterility)是作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)，另一方面，它又是研究細(xì)胞質(zhì)遺傳、核質(zhì)互作和花粉發(fā)育的極好材料。因此，成為當(dāng)前分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的熱點(diǎn)之一。已有大量的試驗(yàn)證實(shí)，細(xì)胞質(zhì)遺傳雖然獨(dú)立于核基因組，但細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間存在著不可分割的依存關(guān)系，其間的相互作用對(duì)生物的生長(zhǎng)和發(fā)育起著重要的作用。目前由于對(duì)胡蘿卜核質(zhì)互作雄性不育(G-CMS)的產(chǎn)生及不育機(jī)理缺乏深入研究和了解，在很大程度上

2、阻礙了胡蘿卜CMS在實(shí)際育種中的充分利用，胡蘿卜的雜種優(yōu)勢(shì)利用仍然比較落后。因此，有必要進(jìn)一步分離與胡蘿卜雄性不育密切相關(guān)的基因，為搞清核質(zhì)互作不育機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，最終利用基因工程手段創(chuàng)造胡蘿卜雄性不育新材料，使其盡快應(yīng)用到胡蘿卜的雜種生產(chǎn)當(dāng)中。 本研究采用cDNA-AFLP技術(shù)結(jié)合分離群體分組混合分析法(Bulkedsegregantanalysis，BSA)，研究瓣化型胡蘿卜核質(zhì)互作雄性不育系和保持系的花器官發(fā)育過程中基因

3、轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異，克隆了不育相關(guān)基因，并對(duì)其進(jìn)行了序列相似性比較分析。此外，還通過CAPS標(biāo)記的篩選，分別獲得不育系和保持系的atp6基因片段，分析了二者的差異以及對(duì)瓣化型胡蘿卜雄性不育發(fā)生的影響。主要研究結(jié)果如下： 1.分別以不育系和保持系的cDNA混合池為模板，選用128對(duì)E+2/M+3的選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行育性差異和時(shí)期差異的篩選，在此基礎(chǔ)上分析得到了3條與胡蘿卜雄性不育基因相關(guān)的差異表達(dá)cDNA片段。 2.序列分析表明

4、，BY1949cDNA片段長(zhǎng)度為364bp，推導(dǎo)的ORF編碼120個(gè)氨基酸，與來源于擬南芥第五號(hào)染色體的質(zhì)子依賴性的類肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和膜蛋白基因有58％的同源性，與水稻Neff突變體蛋白也有40％的同源性。相關(guān)文獻(xiàn)的查詢發(fā)現(xiàn)，該基因的編碼產(chǎn)物影響花粉膜狀層和孢子外壁脂質(zhì)的積累導(dǎo)致了擬南芥的雄性不育。 3.BY2562cDNA片段長(zhǎng)度為432bp，編碼88個(gè)氨基酸的開放閱讀框，與雄性不育胡蘿卜、向日葵、油菜和擬南芥等多種作物的線粒

5、體功能蛋白高度同源，同源性達(dá)90％以上，并具有線粒體膜蛋白YMFl9的保守結(jié)構(gòu)域。通過GenBankBLAST的查詢發(fā)現(xiàn)，YMF19參與了蕓苔屬作物不育性的形成。 4.BY1162cDNA片段長(zhǎng)度為637bp，編碼143個(gè)氨基酸的開放閱讀框，具有g(shù)lyA基因及其編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(serinehydroxymethyl-transferase，SHMT)的保守結(jié)構(gòu)域。SHMT為一種光呼吸的關(guān)鍵酶，在線粒體和葉綠體中行使功能

6、。 5.基于同源序列的候選基因法，通過檢索GenBank的DNA和cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得atp6基因的保守序列，經(jīng)生物學(xué)軟件分析，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物，在瓣化型胡蘿卜雄性不育系和保持系之間進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，不育系和保持系間的特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物未表現(xiàn)多態(tài)性。 6.利用5種在基因組中出現(xiàn)切割位點(diǎn)頻率較高的限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，MseⅠ，AdeI，HindⅢ和BglⅡ?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，對(duì)酶切后表現(xiàn)多態(tài)性的P