西瓜核雄性不育兩用系育性基因的AFLP分子標(biāo)記研究.pdf

1、西瓜(Citrullus lanatus Mansfeld；Watermelon)雜種優(yōu)勢(shì)明顯，目前我國(guó)西瓜生產(chǎn)均使用雜交種。利用雄性不育系進(jìn)行西瓜雜交種生產(chǎn)，可以大大節(jié)省人力物力，有效降低成本。研究西瓜核雄性不育的分子機(jī)理，獲得相關(guān)分子標(biāo)記和基因片段，能夠?yàn)椴挥暝缙阼b別和培育優(yōu)良不育系提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。AFLP（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）是一種高效、快捷、穩(wěn)定、可靠的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，在分子標(biāo)記輔助育種上得到廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)旨在構(gòu)建適

2、合于西瓜的AFLP分子標(biāo)記反應(yīng)體系，并利用AFLP分子標(biāo)記對(duì)G17AB雄性不育兩用系進(jìn)行研究以期獲得與育性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，為不育株早期鑒別提供快速簡(jiǎn)便的方法，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.確定了適于AFLP分析的西瓜基因組DNA的提取方法（改良CTAB法），其提取液成分為：100mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mol/L NaCl,2％ CTAB，1％ PVP

3、40和0.2％ β-巰基乙醇(用前加)。粗提后的DNA用Rnase酶去除RNA，氯仿/異戊醇抽提兩次，無(wú)水乙醇沉淀，得到了RNA去除徹底、純度高、分子量大、質(zhì)量好的西瓜基因組DNA。
　　 2.建立了適于西瓜分析的AFLP銀染技術(shù)體系：在20μl酶切體系中，包括基因組DNA 500ng，EcoR I和Mse I的用量各為3U，Tango Buffer 2μl，酶切時(shí)間以37℃下酶切4小時(shí)、65℃15分鐘為最佳；加入接頭后,37℃

4、連接l0h以上(或過(guò)夜)；連接產(chǎn)物稀釋5倍后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)體系總體積為20μl，其中連接產(chǎn)物5.0μl、含Mg2+的10×Buffer 2.0μl、dNTP（2.5mM）1.6μl、Moo(50ng/μl)和 Eoo(50ng/μl)各0.6μl、Taq聚合酶(5U/μl)0.2μl；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋5倍后再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增體系亦為20μl，其中預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物5.0μl、含Mg2+的10×Buffer 2.0μl、dNTP（2.5m

5、M）1.8μl、Moo(50ng/μl)和 Eoo(50ng/μl)各0.8μl、Taq聚合酶(5U/μl)0.2μl；選擴(kuò)完成后,在20μl體系中加10μl Loading buffer，95℃變性10min，立即冰上冷卻；在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分析,強(qiáng)堿銀染法檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
　　 3.在對(duì)16個(gè)EcoR I引物和16個(gè)Mse I引物共256對(duì)選擇引物組合的篩選中，有238對(duì)引物可以擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰條帶，表現(xiàn)出很高