日本血吸蟲Rio2和Rio2蛋白激酶基因克隆和表達.pdf

1、日本血吸蟲是流行于東南亞的熱帶或亞熱帶地區(qū)及我國南方的人畜共患寄生蟲。它能感染豬、牛、羊、狗、嚙齒動物等多種哺乳動物和人，引起日本血吸蟲病;因此我國對日本血吸蟲病的防制投入了大量的人力和財力。50年的抗血吸蟲病戰(zhàn)役使我們獲得了日本血吸蟲病防制的三條經(jīng)驗:化學藥物療法、滅螺和防治宣傳教育。不同的綜合防制策略有效地抑制了日本血吸蟲病在我國的發(fā)病率;但是這并不能根除日本血吸蟲病在我國的流行。迄今為止，仍沒有疫苗可用于防控日本血吸蟲病;而抗吡喹

2、酮血吸蟲株的出現(xiàn)對我們僅依賴一種藥物來防治該病提出了警示，說明急需開發(fā)新的藥物和疫苗。
　　 蛋白激酶調(diào)控生物體內(nèi)包括DNA復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞周期進程等一系列細胞過程，許多蛋白激酶也是極其重要的藥物靶標。根據(jù)結(jié)構(gòu)差異，蛋白激酶分為真核蛋白激酶(ePKs)和非典型蛋白激酶(aPKs)。非典型蛋白激酶包括13個家族，RIO激酶是非典型蛋白激酶家族的一員。RIO激酶是ATP依賴的絲氨酸蛋白激酶，由Rio1、Rio2和Rio3三個成

3、員構(gòu)成。Rio1和Rio2存在于從古菌到人的各種生物體內(nèi)，而Rio3僅存在于多細胞真核生物體內(nèi)。古菌Rio1和Rio2的晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)RIO激酶都包含一個保守的RIO激酶結(jié)構(gòu)域。酵母Rio1和Rio2的功能研究表明RIO激酶的主要功能是調(diào)控核糖體的生物合成和細胞周期進程。目前，沒有研究吸蟲RIO激酶的任何文章報道。因此，本課題對日本血吸蟲Rio1和Rio2進行了以下方面的研究:
　　 1)日本血吸蟲Rio1和Rio2 cDNA

4、全長序列的獲得及相關(guān)生物信息學分析通過RACE技術(shù)獲得日本血吸蟲Rio1和Rio2蛋白編碼基因cDNA全長序列。日本血吸蟲Sj-rio1開放閱讀框長1269bp，編碼422個氨基酸;其編碼區(qū)包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，外顯子分別長139bp、488bp和642bp，內(nèi)含子的長度依次為3036bp和7188bp。而日本血吸蟲Sj-rio2開放閱讀框長1476bp，編碼491個氨基酸;其編碼區(qū)包含7個外顯子和6個內(nèi)含子，外顯子分別長69bp

5、、154bp、350bp、335bp、96bp、307bp、165bp，內(nèi)含子的長度依次為38bp、154bp、36bp、4751bp、1406bp、2636bp。進化樹分析結(jié)果顯示日本血吸蟲Sj-rio1和Sj-rio2與曼氏血吸蟲同源序列親緣關(guān)系最近，與線蟲的親緣關(guān)系比與哺乳動物的親緣關(guān)系更近。序列比對分析發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲Sj-rio1和Sj-rio2均存在和其它同系物相似的保守結(jié)構(gòu)域，不同的是日本血吸蟲和曼氏血吸蟲rio2的wHTH

6、、磷酸結(jié)合位點(P-環(huán))、Hinge、催化區(qū)的多肽序列比其他同系物在這些結(jié)構(gòu)域的序列都要長。蛋白質(zhì)性質(zhì)預測表明日本血吸蟲Rio1和Rio2蛋白均為無信號肽的球蛋白。
　　 2)日本血吸蟲Sj-rio1和Sj-rio2 mRNA的Northern雜交[γ-32p]ATP標記日本血吸蟲Sj-rio1和Sj-rio2的特異DNA片段作為探針，并分別與固定在尼龍膜上的日本血吸蟲總RNA進行雜交。Northern雜交結(jié)果顯示，日本血吸蟲S

7、j-rio1和Sj-rio2探針與尼龍膜上mRNA的雜交帶均只呈現(xiàn)單一條帶，表明日本血吸蟲Sj-rio1和Sj-rio2 mRNA不存在可變剪接，即只有一個轉(zhuǎn)錄子。
　　 3)大腸桿菌中表達日本血吸蟲Rio1和Rio2蛋白分別將日本血吸蟲Rio1或Rio2ORF全長序列插入pGEX-6P-1或pET32-a原核表達載體。獲得了GST和6×His標簽融合的重組Rio1或Rio2蛋白。生物信息學預測分析顯示日本血吸蟲Rio1的254

8、-422位氨基酸和日本血吸蟲Rio2的251-491位氨基酸的C-端序列特異性和抗原性均較高，因而我們表達并純化了日本血吸蟲Rio1或Rio2該段序列的截短蛋白。
　　 4)日本血吸蟲Rio1和Rio2多克隆抗體的制備及應用純化后的Rio1或Rio2截短蛋白用弗氏佐劑乳化后免疫昆明小鼠，42天后處死小鼠收集血清，獲得抗日本血吸蟲Rio1或Rio2的多克隆抗體。ELISA檢測結(jié)果表明，制備的多克隆抗體的效價均為3200;進一步通過

9、Western blot驗證目的蛋白多克隆抗體的免疫反應活性，發(fā)現(xiàn)所制備的多克隆抗體均能特異結(jié)合對應的目的蛋白。分別用抗日本血吸蟲Rio1或Rio2的多克隆抗體免疫印跡日本血吸蟲成蟲總蛋白的Rio1或Rio2體內(nèi)抗原分子，實驗結(jié)果表明日本血吸蟲中Rio1和Rio2低豐度表達。
　　 本研究獲得了日本血吸蟲Rio1和Rio2蛋白激酶編碼基因的全長cDNA序列;分析了日本血吸蟲Rio1和Rio2基因的結(jié)構(gòu);克隆并表達了日本血吸蟲Ri