日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶SjPGK基因的克隆表達(dá)及生物學(xué)特性的初步探索.pdf

1、血吸蟲病(schistosomiasis)是由血吸蟲感染引起的一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。目前，以化學(xué)藥物吡喹酮對血吸蟲病進(jìn)行治療是血吸蟲病防控采用的最主要措施，但吡喹酮不能避免重復(fù)感染，且近年來曼氏血吸蟲已有吡喹酮抗性蟲株的報(bào)道。因此，加強(qiáng)血吸蟲病疫苗候選分子的篩選和疫苗的研制開發(fā)將是血吸蟲病防治的重大需求。糖酵解途徑是血吸蟲能量代謝最重要途徑之一。磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，該酶的缺乏可引起生物體代謝

2、等功能的紊亂。作者從大鼠、小鼠來源10d童蟲差異表達(dá)基因以及日本血吸蟲體被表膜蛋白的研究基礎(chǔ)上，選擇SjPGK基因開展了以下研究:
　　 1.日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶SjPGK的克隆和表達(dá)分析克隆了日本血吸蟲SjPGK基因，生物信息學(xué)分析表明該基因全長1398bp，其中ORF為1251bp，編碼416個(gè)氨基酸，理論分子量為44382.21Daltons，理論等電點(diǎn)為6.57，SjPGK和SmPGK氨基酸序列的相似性為94％。以看

3、家基因Tublin為內(nèi)參，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了SjPGK基因在日本血吸蟲7d、14d、21d、28d、35d蟲體和42d雌雄蟲體內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果表明，SjPGK基因在日本血吸蟲蟲體的各個(gè)階段均有轉(zhuǎn)錄，其中在21d蟲體內(nèi)表達(dá)量最高，雄蟲的表達(dá)量明顯高于雌蟲，在血吸蟲適應(yīng)性宿主小鼠來源的蟲體中表達(dá)量高于非適應(yīng)性宿主大鼠來源蟲體。成功構(gòu)建了pET-28a-SjPGK重組原核表達(dá)質(zhì)粒，通過優(yōu)化表達(dá)條件使重組蛋白在E.coli(DE

4、3)中呈可溶性表達(dá)，分子量為44KDa，Western blotting分析表明該重組蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。
　　 2.日本血吸蟲重組蛋白pET-28a-SjPGK酶學(xué)活性研究日本血吸蟲SjPGK重組蛋白以1，3-二磷酸甘油酸和ATP為底物，與3-磷酸甘油醛脫氫酶偶聯(lián)，通過檢測還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的吸光度來檢測重組蛋白酶活力。酶動力學(xué)研究表明重組蛋白的比活力為125U/mg，相對于底物3-PGA的米氏

5、常數(shù)Km值為2.69mmol/L，相對于底物ATP的米氏常數(shù)Km值為1.51mmol/L，當(dāng)pH在8-9之間，溫度在30-35℃之間，該重組蛋白酶活性最高。
　　 3.小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)及SjPGK蛋白的組織定位用純化的pET-28a-SjPGK重組蛋白與206佐劑結(jié)合免疫BALB/c小鼠，與對照組相比，免疫小鼠獲得了34.5％的減蟲率(P＜0.05)和32.2％的減卵率(P＞0.05)。用ELISA方法檢測小鼠血清中特異性IgG

6、抗體水平及IgG1和IgG2a抗體亞型的變化，結(jié)果表明，在第一次免疫后抗重組蛋白特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體迅速產(chǎn)生且一直維持在一個(gè)較高的水平。這可能與重組蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)部分免疫保護(hù)作用有關(guān)。
　　 利用熒光免疫技術(shù)觀察SjPGK蛋白在日本血吸蟲7d、21d、28d、35d蟲體及42d雌雄中的表達(dá)定位，結(jié)果顯示，PGK蛋白在日本血吸蟲的各個(gè)蟲體均有表達(dá)，主要分布在體被表膜上。提取日本血吸蟲42d蟲體體被表膜蛋白，W