殼寡糖誘導(dǎo)的灰霉孢子胞內(nèi)活性氧動態(tài)及蛋白質(zhì)差異表達(dá)研究.pdf

1、灰霉（Botrytis cinerea）侵染引起腐爛是造成果實(shí)采后損失的重要原因之一，目前最常用的病害防治方法是使用化學(xué)殺菌劑，但近年來化學(xué)農(nóng)藥濫用所引起的殘留和環(huán)境污染已引起公眾的廣泛關(guān)注，因此，可替代的生物農(nóng)藥的研發(fā)成為果蔬產(chǎn)后領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。殼聚糖是一種具有活性氨基和羥基的堿性多糖，有多種生物學(xué)功能，已有研究表明殼聚糖及其降解產(chǎn)物殼寡糖可以有效地抑制灰霉病的發(fā)生和擴(kuò)展，且具有綠色環(huán)保、易降解、生物相容性等傳統(tǒng)農(nóng)藥不具有的優(yōu)勢特點(diǎn)，

2、具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，對殼聚糖及殼寡糖對灰霉的抑制規(guī)律已有大量的研究報(bào)道，但關(guān)于其抑菌機(jī)理方面的認(rèn)識不足，影響其未來在農(nóng)業(yè)上的推廣應(yīng)用。本論文采用熒光標(biāo)記和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，從細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)角度開展了殼寡糖抑菌機(jī)制的研究，結(jié)果如下。
　　通過熒光分子標(biāo)記技術(shù)，觀察不同濃度殼寡糖單獨(dú)或外源添加過氧化氫、還原劑過氧化氫酶處理對灰霉孢子內(nèi)部活性氧在0，15，30，45，60，90，120，150和180min各時(shí)間點(diǎn)的動態(tài)變化情況

3、。在不同濃度的殼寡糖處理中，選取0.5％和0.05%高低兩種濃度，發(fā)現(xiàn)殼寡糖處理組與對照組在0min均存在有微弱的ROS信號，對照組在15min之后ROS信號基本消失，殼寡糖處理組ROS信號隨時(shí)間延長呈現(xiàn)迅速下降后逐步增加的趨勢，低濃度殼寡糖處理組的ROS信號略強(qiáng)于高濃度殼寡糖處理組，兩者誘導(dǎo)的ROS在120min左右強(qiáng)度基本相同。經(jīng)過50mmol/L外源過氧化氫誘導(dǎo)灰霉孢子1h后，發(fā)現(xiàn)過氧化氫誘導(dǎo)組與對照組相比，ROS信號明顯降低，且

4、這種差距隨著作用時(shí)間的延長逐漸縮短，在120min左右實(shí)驗(yàn)組與對照組的ROS水平基本相同。用3mg/ml過氧化氫酶作為還原劑處理灰霉孢子，發(fā)現(xiàn)還原劑處理組的ROS水平明顯低于殼寡糖對照組，兩者的差距在60-90min達(dá)到最大，90min之后差距逐漸縮短，在180min左右ROS水平基本持平。激光共聚焦顯微鏡觀察殼寡糖處理組與對照組的ROS在灰霉孢子內(nèi)部的分布情況，發(fā)現(xiàn)對照組中孢子內(nèi)部的ROS分布均勻且信號微弱，殼寡糖處理組中孢子內(nèi)部的R

5、OS主要分布在四周區(qū)域，中間大面積區(qū)域基本沒有ROS信號的存在。活性氧熒光標(biāo)記的結(jié)果表明，殼寡糖處理顯著誘導(dǎo)了灰霉孢子內(nèi)ROS水平的積累，且ROS濃度與作用時(shí)間有一定的正相關(guān)性，低濃度的殼寡糖誘導(dǎo)效果略好于高濃度殼寡糖；經(jīng)低濃度過氧化氫誘導(dǎo)的灰霉孢子，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，可以提高灰霉孢子對ROS的耐受能力；外源添加過氧化氫酶，可以顯著降低殼寡糖對灰霉孢子內(nèi)部ROS的誘導(dǎo)；殼寡糖處理的灰霉孢子，不僅其內(nèi)部ROS水平高于對照組，而且在胞內(nèi)分布

6、不均，細(xì)胞中央位置的ROS極少分布，同時(shí)，殼寡糖誘導(dǎo)使灰霉孢子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。
　　選擇濃度為0.05%的殼寡糖處理灰霉孢子8h，用Tris飽和酚抽提的方法提取灰霉孢子內(nèi)部全蛋白，經(jīng)過雙向電泳、和圖譜比對，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)61個(gè)，對其中28個(gè)點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫搜索查詢，成功鑒定出23個(gè)蛋白點(diǎn)，共18種蛋白質(zhì)，其中表達(dá)量上調(diào)的有4種，下調(diào)的有14種，除功能不明確的蛋白之外，其功能分別與物質(zhì)代謝，蛋白合成，蛋白