紅笛鯛lck和tdt基因的克隆及表達分析.pdf

1、魚類T淋巴細胞酪氨酸激酶（Lymphocyte cell kinase，LCK）和末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）均是效應(yīng)T細胞形成的必要因子，在T細胞介導的免疫應(yīng)答中具有重要作用，對其編碼基因在細菌誘導下的表達模式進行研究，有助于揭示魚類抗菌免疫的分子機制。本研究通過同源克隆和RACE技術(shù)獲得紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）lck和tdt基因序

2、列全長，并利用免疫組織化學技術(shù)及原位雜交技術(shù)對其定位進行驗證分析。結(jié)果如下：
　　1.lck和tdt基因全長的獲得及序列分析：基因克隆獲得lck基因cDNA序列全長為2279 bp，完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）為1506 bp，編碼501個氨基酸。預(yù)測分子量（MW）為57.4 kDa，理論等電點（pI）為4.98。tdt基因cDNA序列全長為1710 bp，ORF為1392 bp，編碼463個氨基

3、酸。預(yù)測MW為52.6 kDa，理論pI為6.66構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹分析顯示，紅笛鯛lck和tdt分別與大菱鲆（Scophthalmus maximus）和尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的相應(yīng)基因親緣關(guān)系較近。另外，PSORT II預(yù)測結(jié)果顯示lck編碼的蛋白主要分布于細胞質(zhì)，幾率為39.1％，tdt編碼的蛋白主要分布于線粒體，幾率為60.9%。
　　2.lck和tdt基因不同組織差異表達分析：以β-act

4、in基因為內(nèi)參，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)，對哈氏弧菌 ZJ0706感染前后，紅笛鯛lck和tdt在肝臟、頭腎、脾臟、胸腺、小腸、肌肉、鰓絲、皮膚、心臟、中腎和腦共11個組織中的表達進行定量分析，結(jié)果如下：lck在感染前后都能在頭腎、胸腺和脾臟中檢測到相應(yīng)mRNA的表達，且最大表達量都出現(xiàn)在誘導后36h；tdt在感染前后都能在頭腎和胸腺中檢測到相應(yīng)mRNA的表達，且最大表達量都出現(xiàn)在誘導后48h。
　　3.lck和tdt基

5、因定位分析：采用免疫組織化學技術(shù)研究在蛋白水平上LCK和TdT的分布。利用pET-28a(+)和pET-32a(+)載體構(gòu)建pET28-LCK和pET32-TdT原核表達質(zhì)粒，獲得LCK和TdT融合蛋白，并利用Western blot技術(shù)檢測蛋白表達的準確性并制備鼠抗LCK和TdT多克隆抗體。結(jié)果顯示：LCK和TdT融合蛋白均可與鼠抗His-Tag單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，說明目的基因成功表達；通過ELISA檢測顯示LCK和TdT抗血清

6、效價均達到1：30000以上；抗血清能與LCK和TdT融合蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；利用上述抗血清進行免疫組織化學分析，LCK蛋白主要分布于胸腺、頭腎及脾臟器官的淋巴細胞中，TdT蛋白主要分布于頭腎和胸腺器官的淋巴細胞。采用lck和tdt基因原位雜交技術(shù)研究LCK和TdT在mRNA水平的免疫器官的分布，結(jié)果顯示，lck mRNA在頭腎、脾臟和胸腺組織中的分布，且在胸腺中的信號最強烈，tdt mRNA在頭腎和胸腺組織中的分布,在胸腺中的信號