抑制素和JAK-STAT信號途徑關(guān)系因子在甲殼動物免疫反應(yīng)中的功能研究.pdf

1、甲殼動物是重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖動物，甲殼動物的養(yǎng)殖與捕撈量占世界水產(chǎn)品總量的百分之十。然而，近年來水產(chǎn)病害頻發(fā)使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)蒙受了巨大的損失。為了防控甲殼類水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害的發(fā)生，對它們先天免疫機理的深入研究是很有必要的。雖然經(jīng)過近20年的不懈努力，甲殼動物先天免疫的研究取得了顯著的成果，但距離真正解決水產(chǎn)病害這一難題還有一定的距離，很多先天免疫的分子機制還有待揭示。
　　本論文中，作者從克氏原螯蝦中鑒定出一種抑制素，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制病毒復(fù)制

2、。還初步探討了對蝦JAK/STAT信號通路的組成以及在對蝦細菌免疫中的功能與調(diào)控。
　　1.克氏原螯蝦抑制素參與抗病毒免疫的研究
　　抑制素(Prohibitins，PHBs)是一類在真核生物中廣泛表達的，具有很高保守性的蛋白質(zhì)。它與細胞凋亡、癌癥、細胞死亡、應(yīng)激反應(yīng)、細胞增殖以及免疫調(diào)控等眾多生命反應(yīng)有關(guān)。但是，PHB在甲殼動物免疫中的功能報道還很少。本研究中從克氏原螯蝦中鑒定出一種抑制素，生物信息學分析確定其為抑制素1，

3、命名為PcPHB1。PcPHB1在小龍蝦各組織中廣泛表達，在白班綜合征病毒(WSSV)刺激后其在核酸水平和蛋白水平的表達量都有明顯的提高。研究發(fā)現(xiàn)，在病毒刺激下，與對照組相比PHB1重組蛋白能夠明顯的降低克氏原螯蝦的死亡率。同時，當用RNA干擾的方法在龍蝦體內(nèi)敲降PHB1的表達，并感染W(wǎng)SSV后，克氏原螯蝦的死亡率明顯增加。拯救實驗（即在PHB1干擾后，向克氏原螯蝦體內(nèi)注入PHB1重組蛋白，之后再使克氏原螯蝦感染病毒）表明，PHB1重組

4、蛋白能夠減少克氏原螯蝦的死亡率。為了進一步研究PHB1抗病毒免疫的分子機制，我們檢測了PHB1與病毒蛋白的相互作用。Pull-down和Far-western等實驗表明，PHB1可能同病毒的囊膜蛋白VP24、VP26和VP28相互作用。據(jù)報道VP28參與病毒侵染宿主細胞的過程，能夠幫助病毒進入宿主細胞。VP26在病毒裝配過程中發(fā)揮了重要作用，而VP24在病毒感染的早期發(fā)揮作用。因此，PHB1可能通過與病毒囊膜蛋白VP28、VP26和VP

5、24的相互作用，抑制病毒的侵染和病毒感染后病毒的組裝。這是甲殼動物PHB1參與抗病毒免疫的首次報道。
　　2.日本對蝦信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活信號通路(JAK/STAT)參與細菌免疫的研究
　　JAK-STAT信號通路是一條由細胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學過程。該信號通路的傳遞過程相對簡單，它主要由三個成分組成，即酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT。近年來發(fā)

6、現(xiàn)細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制子(Suppressorofcytokinesignaling，SOCS)是一類STAT誘導(dǎo)表達的STAT的抑制因子(SSI)，它能夠負調(diào)控JAK/STAT信號通路。在果蠅中，JAK/STAT信號通路與其發(fā)育和細胞及體液免疫反應(yīng)有關(guān)。在對蝦中，有報道稱在ployIC以及PGN刺激下，STAT能夠被誘導(dǎo)上調(diào)表達。在凡納濱對蝦中，WSSV刺激下STAT發(fā)生磷酸化，并且STAT磷酸化后進入細胞，調(diào)控效應(yīng)分子的表達。JAK

7、/STAT信號通路在甲殼動物中參與細菌免疫反應(yīng)的報道很少，其參與抗細菌免疫的分子機制還有待闡明。在本研究中，我們鑒定了日本囊對蝦JAK/STAT通路的四種成分，包括膜受體MjDome，膜受體配體MjIL-CTL，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子MjSTAT和細胞因子信號通路抑制因子MjSOCS2。它們有類似的組織分布，都在心、腮和腸中有較高的表達水平。MjSTAT和MjSOCS2在弧菌刺激后有上調(diào)表達的趨勢。為了研究該途徑的功能，作者首先建立了對蝦

8、中該途徑的標志:弧菌刺激能夠引起STAT的磷酸化。進一步研究發(fā)現(xiàn)弧菌表面分子脂多糖(LPS)可以誘發(fā)STAT的磷酸化過程。同時，本研究鑒定到LPS的可能的受體(MjIL-CLT)介導(dǎo)了LPS與JAK/STAT信號通路的受體Dome的結(jié)合。我們用LPS作為誘導(dǎo)劑，篩選出五種被JAK/STAT通路特異性調(diào)控的抗菌肽，包括ALF4、ALF5、ALF6、Cru3和Cru4。STAT被干擾后，對蝦對細菌的清除能力減弱，對蝦的死亡率增加。作者還對J

9、AK/STAT途徑的調(diào)控進行研究，發(fā)現(xiàn)SOCS2能夠抑制STAT的磷酸化過程。SOCS2被干擾后，對蝦對細菌的清除能力增強，對蝦的死亡率減少。這些結(jié)果表明，JAK/STAT信號通路通過調(diào)節(jié)抗脂多糖因子和甲殼肽等抗菌肽的表達參與細菌免疫過程。
　　3.日本對蝦一種含有跨膜結(jié)構(gòu)域的甲殼肽參與細菌免疫的研究
　　甲殼肽(Crustins)是甲殼動物中特有的、含有乳清酸蛋白結(jié)構(gòu)域、一般具有抑制蛋白酶和抑制細菌活性的抗菌肽。在本研究中

10、，我們從日本囊對蝦中克隆并鑒定了一種新型的甲殼肽，它含有一個信號肽，一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個乳清酸蛋白(wheyacidicprotein，WAP)結(jié)構(gòu)域，命名為MjMCru。MjMCru在心臟、鰓、胃和腸中有較高的表達水平，在血細胞和肝胰腺中表達量較低。在弧菌和金黃色葡萄球菌刺激后MjMCru在血細胞中的表達量明顯增加。在對蝦體內(nèi)注射MjMCru的WAP多肽，能夠有效的減少弧菌和金黃色葡萄球菌刺激下對蝦的死亡率。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MjMCr