對(duì)蝦β抑制蛋白對(duì)Toll和Jak-Stat信號(hào)通路的調(diào)控及纖維蛋白原相關(guān)蛋白在對(duì)蝦抗細(xì)菌免疫中的功能研究.pdf

1、脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)由先天免疫和適應(yīng)免疫組成，無脊椎動(dòng)物缺乏特有的適應(yīng)性免疫，主要依靠先天免疫抵御病原微生物的入侵。有關(guān)果蠅的先天免疫研究的比較深入，發(fā)現(xiàn)了果蠅中存在三條主要的免疫相關(guān)信號(hào)通路，Toll、IMD和Jak/Stat信號(hào)通路，有關(guān)這三條信號(hào)通路的調(diào)控也有相關(guān)報(bào)道。在其他無脊椎動(dòng)物如對(duì)蝦中，也存在類似的信號(hào)通路，但是關(guān)于這些信號(hào)通路調(diào)控的研究報(bào)道卻很少。本論文主要研究了對(duì)蝦中Toll和Jak/Stat信號(hào)通路的調(diào)控;另外還對(duì)感知

2、和識(shí)別病原的模式識(shí)別受體纖維蛋白原相關(guān)蛋白在抗細(xì)菌免疫中的功能開展了研究。
　　1.β抑制蛋白通過調(diào)控Dorsal的核移位和轉(zhuǎn)錄活性來負(fù)性調(diào)控Toll信號(hào)通路
　　Toll信號(hào)通路在果蠅和哺乳動(dòng)物先天免疫中起著非常重要的作用。Toll信號(hào)通路的激活和抑制在這些生物中受到精細(xì)的調(diào)控。盡管已經(jīng)在對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)了Toll信號(hào)通路的一些關(guān)鍵的分子元件，但是關(guān)于這條信號(hào)通路的功能和調(diào)控研究的很少。為了研究β抑制蛋白(β-arrestins

3、)對(duì)Toll信號(hào)通路的調(diào)控，我們首先利用Staphylococcus aureus刺激對(duì)蝦，檢測(cè)Toll信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子Dorsal的核移位變化和抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)的表達(dá)，建立了對(duì)蝦中中Toll信號(hào)通路的激活模型，并證明該通路在對(duì)蝦抗細(xì)菌免疫中發(fā)揮重要作用。之后我們發(fā)現(xiàn)β抑制蛋白(β-arrestins)通過兩條途徑負(fù)性調(diào)控Toll信號(hào)通路。β-Arrestins通過其arrestin-N結(jié)

4、構(gòu)域與Cactus的C-terminal PEST結(jié)構(gòu)域相互作用;Cactus通過其ANK重復(fù)結(jié)構(gòu)域和Dorsal的RHD結(jié)構(gòu)域相互作用;進(jìn)而通過Cactus形成β-arrestin-Cactus-Dorsal三聚體。這種復(fù)合體能夠保護(hù)Cactus的磷酸化和降解，抑制Dorsal的轉(zhuǎn)位入核，進(jìn)而抑制Toll信號(hào)通路。β-Arrestins也可以通過arrestin-C結(jié)構(gòu)域和非磷酸化胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)相互作用，從而抑制ERK的磷

5、酸化，進(jìn)而影響Dorsal的轉(zhuǎn)位入核和Dorsal的Serine276磷酸化，影響了Dorsal的轉(zhuǎn)錄活性。我們的研究說明β-arrestins通過抑制Dorsal的轉(zhuǎn)位入核，磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性來負(fù)性調(diào)節(jié)Toll信號(hào)通路。
　　2.β-Arrestin1與TC45互作使Stat去磷酸化進(jìn)而抑制抗菌肽的表達(dá)
　　信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的磷酸化與去磷酸化在調(diào)控信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)中具有重要作用。在Jak/Stat通路中，損壞磷酸酶活性會(huì)導(dǎo)

6、致信號(hào)轉(zhuǎn)錄激活因子Stat處于持續(xù)激活的狀態(tài)。在哺乳動(dòng)物中，Stat家族成員可以被同一種磷酸酶去磷酸化。哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了多種Stat分子，在甲殼動(dòng)物中僅發(fā)現(xiàn)了一種Stat，其與哺乳動(dòng)物中的Stat5a/b類似。截至目前，對(duì)蝦中關(guān)于Stat信號(hào)通路調(diào)控的報(bào)道很少。本文研究發(fā)現(xiàn)，β-arrestin1與T細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TC45)在細(xì)胞核中相互作用促進(jìn)Stat去磷酸化從而抑制Stat信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄。首先，我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌刺激條件下，St

7、at轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中上調(diào)抗菌肽的表達(dá)。β-Arrestin1進(jìn)入血細(xì)胞細(xì)胞核中，招募TC45到Stat上，形成β-arrestin1-TC45-Stat復(fù)合體，使Stat有效、快速的去磷酸化。當(dāng)干擾掉β-arrestin1再用鰻弧菌Vibrio anguillarum刺激后，TC45與Stat相互作用減弱，Stat磷酸化水平升高。在形anguillarum刺激下，β-arrestin1在細(xì)胞核中直接與Stat相互作用并招募TC45到Sta

8、t上，加速Stat的去磷酸化，減低其轉(zhuǎn)錄活性。更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，β-arrestin1與TC45可以通過Stat信號(hào)通路影響AMPs的表達(dá)。以上結(jié)果表明，在對(duì)蝦抗細(xì)菌免疫中中，β-arrestin1和TC45通過使Stat的去磷酸化而減少抗菌肽的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Jak/Stat通路的負(fù)調(diào)控。
　　3.一種纖維蛋白原相關(guān)蛋白參與對(duì)蝦的抗細(xì)菌免疫
　　在無脊椎動(dòng)物中，纖維蛋白原相關(guān)蛋白(FREPs)在先天免疫中具有重要的功能。本文中

9、，我們從日本囊對(duì)蝦中鑒定出一種FREP，并將其命名為MjFREP2。MjFREP2的全長為1138 bp，包括954 bp的開放閱讀框，編碼317aa，由一個(gè)信號(hào)肽和一個(gè)纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域組成。MjFREP2在血細(xì)胞，心臟，肝胰腺，鰓，胃和腸中都有能檢測(cè)到。當(dāng)對(duì)蝦受到V.anguillarum和S.aureus刺激后，MjFREP2在血細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)。凝集實(shí)驗(yàn)和結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組表達(dá)的MjFREP2能結(jié)合細(xì)菌和多糖。免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)