纖維蛋白原、纖維蛋白及其降解產(chǎn)物參與動脈粥樣硬化的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討不同濃度水平的纖維蛋白原（Fg）及其降解產(chǎn)物（Fb和FDPs）在動脈粥樣硬化（AS）發(fā)病中的作用及其分子機(jī)制。 方法：①以Transwell膜為載體，建立原代培養(yǎng)的兔主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）和平滑肌細(xì)胞（SMCs）共培養(yǎng)體系，對兩種細(xì)胞的生長特性和SMCs的正常表型轉(zhuǎn)換規(guī)律進(jìn)行觀察。②應(yīng)用不同濃度（0mg/ml、0.5mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml和6.0mg/ml）Fg、Fb和FDP

2、s對共培養(yǎng)體系進(jìn)行干預(yù)，觀察該體系中SMCs的蛋白合成（BCA法）、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換標(biāo)志物α—SM—actin（RT—PCR法）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）（western blot法）以及細(xì)胞移行（刮傷模型）變化。③應(yīng)用在不同濃度Fg、Fb和FDPs干預(yù)共培養(yǎng)體系后，分別從基因轉(zhuǎn)錄（RT—PCR法）、蛋白表達(dá)（ELISA法）和活性交化（發(fā)色底物法，明膠酶譜法/MTT法）水平檢測該體系tPA、PAI—1、MMP—2、—8和VEGF的表達(dá)情況

3、，并觀察在此過程部分濃度組別中ECs和SMCs核轉(zhuǎn)錄因子（NF）—κB途徑活化情況。④應(yīng)用HE染色對人AS不穩(wěn)定斑塊進(jìn)行了組織學(xué)觀察、篩選，然后利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察MMP—2、—8和VEGF在人不穩(wěn)定斑塊上的定位共表達(dá)情況。 結(jié)果：⑴原代培養(yǎng)的兔主動脈ECsⅧ因子抗體免疫組化染色呈陽性。在共培養(yǎng)條件下，ECs和SMCs在Transwell膜上生長良好，ECs單層生長，呈“鵝卵石”樣外觀；SMCs多層生長，呈

4、明顯“蜂—谷”狀外觀。膜兩側(cè)的ECs和SMCs可以發(fā)生細(xì)胞連接。從第3天開始SMCs表現(xiàn)為增殖表型的形態(tài)特征，第6天以后，出現(xiàn)收縮表型的形態(tài)特征。⑵較高濃度的Fg（≥3.0mg/ml）可明顯促進(jìn)SMCs的蛋白合成、PCNA表達(dá)以及趨化遷移，同時抑制SMCsα—SM—actin的轉(zhuǎn)錄過程；Fb從0.5mg/ml起就可明顯促進(jìn)SMCs的蛋白合成。1.5—4.5mg/ml的Fb可明顯上調(diào)PCNA表達(dá)，濃度過高的Fb（6.0mg/ml）反而抑制

5、其表達(dá)。3.0—6.0mg/ml的Fb顯著促進(jìn)SMCs趨化，下調(diào)α—SM—actin mRNA的表達(dá)，但從1.5mg/ml起Fb就可明顯加強(qiáng)SMCs的遷移過程；在0.5—6.0mg/ml之間，F(xiàn)DPs呈濃度依賴性地促進(jìn)SMCs蛋白合成、PCNA表達(dá)和移行，但只有較高濃度的FDPs（3.0—6.0mg/ml）可顯著抑制SMCs向收縮表型轉(zhuǎn)換。⑶Fg對tPA的表達(dá)沒有顯著影響，較高濃度的Fg（3.0—4.5mg/ml）可明顯促進(jìn)PAI—1m

6、RNA表達(dá)、抗原含量及活性升高，但過高濃度的Fg（6.0mg/ml）卻抑制PAI—1的表達(dá)；3.0—4.5mg/ml的Fb對tPA mRNA和抗原含量都起上調(diào)作用，同時顯著下調(diào)tPA活性；較高濃度的Fb（1.5—4.5mg/ml）則可明顯上調(diào)PAI—1的表達(dá)，且在mRNA、蛋白和活性水平趨勢基本一致；3.0—6.0mg/ml的FDPs均可明顯下調(diào)tPAmRNA、蛋白表達(dá)和活性水平，1.5—6.0mg/ml的FDPs均可促進(jìn)PAI—1的高

7、表達(dá)。⑷4.5—6.0mg/ml的Fg能明顯上調(diào)MMP—2的轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和降解明膠的活性；3.0—6.0mg/ml濃度的Fb顯著能促進(jìn)MMP—2的高表達(dá)和活性上調(diào)；在觀察的FDPs濃度（0.5—6.0mg/ml）范圍內(nèi)，MMP—2 mRNA里濃度依賴性高表達(dá)；但只在中高濃度（1.5—6.0mg/ml）FDPs亞組上清中檢測到MMP—2抗原含量顯著升高和活性上調(diào)。而中濃度（1.5mg/ml）以上的Fg及其降解產(chǎn)物Fb和FDPs均可促進(jìn)V

8、EGF的高表達(dá)，這在mRNA、蛋白和活性水平趨勢基本一致。3.0—6.0mg/ml的Fg、1.5—6.0mg/ml的Fb和FDPs均可呈濃度依賴性地顯著上調(diào)細(xì)胞上清中MMP—8水平，但在過高濃度（6.0mg/ml）的亞組都略有下降，但仍明顯高于空白對照組。在中高濃度（3.0—6.0mg/ml）的Fb和FDPs干預(yù)下，ECs和SMCs均見到NF—xB激活，NF—κB特異拮抗劑SN50能抑制ECs和SMCs MMP—2和VEGF的表達(dá)，對M

9、MP—8的表達(dá)卻沒有影響。⑸所有病例均有AS斑塊的組織學(xué)特征，且均為Ⅳ型以上的不穩(wěn)定性斑塊；MMP—2在單核細(xì)胞浸潤的斑塊纖維帽平滑肌細(xì)胞和肩部單核細(xì)胞中表達(dá)最為顯著，在肩部和脂質(zhì)壞死區(qū)邊緣增生微血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有較多表達(dá)；MMP—8表達(dá)最多見于纖維帽和脂質(zhì)核心內(nèi)的單核細(xì)胞中，其次共表達(dá)在纖維帽的平滑肌細(xì)胞中，內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)很弱很少；VEGF在肩部增生的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)最為明顯，由平滑肌細(xì)胞構(gòu)成的纖維帽和有較多單核細(xì)胞浸潤的脂質(zhì)壞死

10、區(qū)邊緣也是VEGF的高表達(dá)區(qū)域。 結(jié)論：①成功建立了兔主動脈ECs—SMCs共培養(yǎng)體系，該體系能較好地模擬血管壁的結(jié)構(gòu)關(guān)系，有很好的生物相容性，不影響細(xì)胞的生物活性和生長特性。②一定濃度的Fg、Fb及FDPs可以促進(jìn)SMCs增殖和異常表型轉(zhuǎn)換、影響其趨化遷移過程，同時可調(diào)控血管ECs tPA和PAI—1的表達(dá)，降低血液纖溶活性，從而參與了AS的發(fā)生發(fā)展。③Fg、Fb及FDPs通過影響血管ECs—SMCs MMP—2、—8和VEG