泛素化與類(lèi)泛素(SUMO)化在甲殼動(dòng)物免疫反應(yīng)中的功能.pdf

1、甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)重要的出口創(chuàng)匯產(chǎn)業(yè)。然而，自1992年白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)病的爆發(fā)，給我國(guó)乃至世界的水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)參與病毒感染和復(fù)制的宿主蛋白進(jìn)行鑒定和功能分析，對(duì)預(yù)防和控制病毒性疾病有重要的意義。泛素化和SUMO化都需要激活酶E1，結(jié)合酶E2和連接酶E3的參與，從而對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性修飾。盡管類(lèi)泛素SUMO的三維結(jié)構(gòu)和酶促反應(yīng)過(guò)程與泛素非常形似，但兩類(lèi)

2、蛋白修飾的生物學(xué)意義卻迥然不同。本研究選擇對(duì)蝦泛素結(jié)合酶和小龍蝦SUMO結(jié)合酶，分別研究他們介導(dǎo)的泛素化和SUMO化在病毒感染和復(fù)制中的功能，進(jìn)而闡明甲殼動(dòng)物與白斑病毒相互作用的分子機(jī)理。
　　 1.中國(guó)明對(duì)蝦泛素結(jié)合酶E2(FcUbc)介導(dǎo)白斑綜合征病毒含有RING結(jié)構(gòu)域蛋白的泛素化，并抑制病毒的復(fù)制
　　 我們從中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到了一個(gè)泛素結(jié)合酶E2，命名為FcU

3、bc。FcUbc的cDNA全長(zhǎng)967 bp，其中開(kāi)放閱讀框447 bp，編碼148個(gè)氨基酸，包含一個(gè)泛素結(jié)合酶E2催化結(jié)構(gòu)域(UBCc)。FcUbc特異性的分布于對(duì)蝦肝胰腺和小腸中，在受到白斑病毒刺激后，都呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)。在大腸桿菌(Escherichia coli)中重組表達(dá)并純化了FcUbc，用重組蛋白制備的多克隆抗體進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果顯示內(nèi)源FcUbc蛋白定位于肝胰腺的B細(xì)胞和小腸的上皮細(xì)胞。
　　 為了研究其功

4、能，除了重組表達(dá)FcUbc外，我們對(duì)FcUbc的催化活性位點(diǎn)進(jìn)行了突變，重組表達(dá)了其突變體mFcUbc。利用FcUbc重組蛋白注射對(duì)蝦，明顯降低了染毒對(duì)蝦的死亡率，并且大大抑制白斑病毒的復(fù)制。我們利用體外pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組FcUbc能夠結(jié)合病毒的四個(gè)含有RING結(jié)構(gòu)域的蛋白(WRD1-4)，后者被報(bào)道具有潛在的E3連接酶的功能，而突變體mFcUbc喪失了這樣的體外結(jié)合能力。更重要的是，體外泛素化實(shí)驗(yàn)和果蠅S2細(xì)胞系(Dros

5、ophila melanogaster Schneider2)上的實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了FcUbc介導(dǎo)了WSSV277和WSSV304的RING結(jié)構(gòu)域的泛素化。在感染W(wǎng)SSV的果蠅S2細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)的FcUbc增強(qiáng)了病毒W(wǎng)SSV277和WSSV304蛋白的泛素化。以上結(jié)果表明中國(guó)明對(duì)蝦FcUbc介導(dǎo)白斑病毒含RING結(jié)構(gòu)域蛋白的泛素化，并最終抑制病毒的復(fù)制。
　　 2.克氏原螯蝦SUMO結(jié)合酶(UBC9)介導(dǎo)白斑綜合征病毒極早期蛋白的SU

6、MO化修飾并最終促進(jìn)病毒復(fù)制
　　 我們從克氏原螯蝦(Procambarus clarkli)中克隆得到了小泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier, SUMO)和SUMO結(jié)合酶UBC9。UBC9 cDNA全長(zhǎng)912bp，開(kāi)放閱讀框483bp，編碼160個(gè)氨基酸，含有一個(gè)UBCc催化結(jié)構(gòu)域，活性位點(diǎn)是位于93位的保守的半胱氨酸。SUMO cDNA全長(zhǎng)960 bp，開(kāi)放閱讀框282 bp，編

7、碼93個(gè)氨基酸，含有一個(gè)泛素樣結(jié)構(gòu)域(UBQ)，其活性位點(diǎn)是位于C末端的雙甘氨酸殘基。序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析顯示UBC9和SUMO進(jìn)化上高度保守，小龍蝦的UBC9和SUMO與酵母和人類(lèi)的蛋白表現(xiàn)出極高的相似性。UBC9和SUMO組成型的存在于小龍蝦各組織，在白斑病毒刺激后呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。
　　 我們?cè)诖竽c桿菌中重組表達(dá)并純化了克氏原螯蝦的UBC9、SUMO，突變體mUBC9和mSUMO，及SUMO的活性形式SUMO-GG。向克氏原螯

8、蝦體內(nèi)注射UBC9或SUMO重組蛋白增強(qiáng)了WSSV的基因復(fù)制，而突變體mUBC9和mSUMO則喪失此功能。接下來(lái)我們進(jìn)一步分析了克氏原螯蝦SUMO化系統(tǒng)促進(jìn)白斑病毒復(fù)制的分子機(jī)理?？耸显rUBC9蛋白體外結(jié)合WSSV三種極早期蛋白(IE，WSV051，WSV069和WSV187)，其中只有WSV051能夠被宿主UBC9介導(dǎo)發(fā)生SUMO化修飾。利用干擾降低小龍蝦UBC9或SUMO的表達(dá)水平，導(dǎo)致病毒晚期基因表達(dá)被抑制，極早期基因表達(dá)也受