Bmo-miR-305-等對家蠶BmSGF-1、BmFMBP-1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控.pdf

1、家蠶絲腺（Bombyx mori Silk Gland）是一個高效的蛋白質(zhì)合成車間，蠶絲蛋白基因過程存在具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，在此過程中，絲腺細胞因子起到了極其重要的作用。miRNAs作為一類重要的基因表達調(diào)控因子，與生物個體發(fā)育、細胞增殖、分化、代謝等生命過程密切相關(guān)。miRNA的調(diào)控機制也是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，一個miRNA分子可以作用于多個靶基因，而多個miRNAs分子也可以作用于同一靶基因。雖然一些絲蛋白基因的結(jié)合位點和調(diào)控因子已

2、被報道，但仍不足以揭示其精密調(diào)控機制，為了探討家蠶 miRNAs、絲腺特異轉(zhuǎn)錄因子和蠶絲蛋白基因之間的調(diào)控關(guān)系，不僅需要發(fā)現(xiàn)更多的調(diào)控因子或關(guān)鍵調(diào)控位點，更需要研究家蠶miRNAs對絲腺特異性轉(zhuǎn)錄因子基因的調(diào)控作用。本課題以此為目標(biāo)開展研究，并取得以下結(jié)果。
　　1、候選bmo-miRNAs的鑒定
　　利用生物信息學(xué)方法預(yù)測分析可能對 SGF-1或 FMBP-1轉(zhuǎn)錄后表達進行調(diào)控的bmo-miRNAs。結(jié)果獲得20個bmo-

3、miRNAs與BmSGF-13′UTR存在潛在的結(jié)合位點的bmo-miRNAs，13個與BmFMBP-13′UTR存在結(jié)合位點的bmo-miRNAs。
　　利用莖環(huán)PCR方法對候選bmo-miRNAs進行鑒定，并與miRBase數(shù)據(jù)庫比對。結(jié)果獲得6個可能對 SGF-1具有調(diào)控作用的候選 miRNAs，分別為 bmo-miR-305*、bmo-miR-2731-1、bmo-miR-2731-2、bmo-miR-2775a、bmo-

4、miR-3327*和bmo-miR-1a；3個經(jīng)測序確認的可能對FMBP-1具有調(diào)控作用的候選miRNAs，分別為bmo-miR-2b*、bmo-miR-305和bmo-miR-2758。
　　2、候選bmo-miRNAs及其潛在靶基因BmSGF-1和BmFMBP-1的表達特性分析
　　用半定量PCR的方法檢測bmo-miR-2731-1/-2和bmo-miR-2775a的相對表達量，結(jié)果顯示bmo-miR-2731-1/-

5、2和bmo-miR-2775a在后部絲腺（PSG）中的表達量較低。利用定量PCR的方法檢測了bmo-miR-305*、bmo-miR-1a和SGF-1的相對表達情況，結(jié)果顯示bmo-miR-305*和bmo-miR-1a在PSG的相對表達量上與SGF-1存在一定的相關(guān)性。利用半定量PCR的方法檢測bmo-miR-2758和FMBP-1的相對表達水平，結(jié)果顯示bmo-miR-2758在PSG的相對表達量與FMBP-1基因的表達模式呈現(xiàn)一致

6、的趨勢。
　　3、bmo-miR-305*和bmo-miR-3327*對BmSGF-1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用研究
　　分別構(gòu)建 pcDNA3[ie1-egfp-pri-mir-305-SV40]和 pcDNA3[ie1-egfp-pri-mir-3327-SV40]重組質(zhì)粒，并與 pGL3[A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]重組表達載體分別共轉(zhuǎn)染BmN細胞。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了bmo-miR-305*重組質(zhì)粒組的luc

7、熒光素酶活性比未轉(zhuǎn)染時極顯著下調(diào)（P<0.01）；轉(zhuǎn)染了bmo-miR-3327*重組質(zhì)粒組的luc熒光素酶活性比未轉(zhuǎn)染時極顯著下調(diào)（P<0.01）；再各自轉(zhuǎn)染了inhibitors后熒光蛋白表達量均為上調(diào)（P<0.05）。表明bmo-miR-305*和bmo-miR-3327*對SGF-1的轉(zhuǎn)錄后表達具有一定的抑制作用。
　　4、bmo-miR-2758對FMBP-1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用研究
　　構(gòu)建 pcDNA3[ie1-e

8、gfp-pri-mir-2758-SV40]重組質(zhì)粒，并與pGL3[A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]重組表達載體共轉(zhuǎn)染BmN細胞。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了bmo-miR-2758重組質(zhì)粒之后，熒光素酶活性降低，且兩組之間差異極顯著（P<0.01），再轉(zhuǎn)染inhibitors后熒光蛋白表達量上調(diào)（P<0.05），表明bmo-miR-2758對FMBP-1的轉(zhuǎn)錄后表達具有一定的抑制作用。
　　5、bmo-miR-34對BmE

9、74的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用研究
　　利用生物信息學(xué)方法對BmE743′UTR的bmo-mir-34潛在結(jié)合位點進行分析，結(jié)果顯示，BmE743′UTR具有 bmo-miR-34的結(jié)合位點。構(gòu)建 pcDNA3[ie1-egfp-pri-mir-34-SV40]重組質(zhì)粒，并與 pGL3[A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]融合表達載體共轉(zhuǎn)染BmN細胞。結(jié)果顯示，與對照相比，轉(zhuǎn)染了bmo-miR-34重組質(zhì)粒組的細胞熒光素酶活性