水稻編碼病程相關(guān)蛋白PR-4和葡聚糖酶基因的克隆與鑒定.pdf

1、該文報道了水稻中受BTH誘導(dǎo)表達(dá)的兩個病程相關(guān)蛋白基因OsPR-4a和OsGlu的克隆和鑒定.從水稻受BTH誘導(dǎo)表達(dá)的差減雜交cDNA文庫中,選擇一個預(yù)測編碼PR-4蛋白的差別表達(dá)克隆bnhn-n18,以水稻受BTH誘導(dǎo)表達(dá)的全長cDNA文庫DNA為模板,以基因特異引物和載體通用引物,通過PCR克隆了OsPR-4a的cDNA的缺失端.根據(jù)已知序列和克隆的缺失端序列拼接出OsPR-4a的全長cDNA.OsPR-4a全長cDNA為739bp

2、,預(yù)測編碼一個有151個氨基酸組成的蛋白,推測的分子量和等電點分別為16.47kD和4.42.從等電點看,OsPR-4a為一酸性蛋白.以Northernblot分析比較了供試的水稻抗病和感病近等基因系在稻瘟菌接種后OsPR-4a表達(dá)的差異.在不親和互作中,接種36h檢測到OsPR-4a的表達(dá);而親和性互作在供試時間內(nèi)沒有檢測到表達(dá).對水稻稻瘟病感病品種幼苗在0.3mmol/L BTH處理后24h作Northernblot分析,檢測到Os

3、PR-4a表達(dá),而水處理對照在48 h內(nèi)未檢測到表達(dá).克隆的水稻OsPR-4a基因在大腸桿菌中得到了表達(dá),純化的表達(dá)蛋白在體外對水稻稻瘟菌(Magnaporthegrisea)和紋枯菌(Rhizoctoniasolani)的生長都有一定的抑制作用.在抑菌實驗中,對抑菌圈邊緣的菌絲形態(tài)進(jìn)行顯微觀察后發(fā)現(xiàn),與正常菌絲相比,稻瘟病菌和紋枯病菌的菌絲有畸形和不規(guī)則扭曲.用一對根據(jù)OsPR-4a基因序列和水稻基因組序列數(shù)據(jù)庫相應(yīng)序列設(shè)計的引物擴(kuò)增

4、到OsPR-4a基因上游2257 bp的啟動子序列.用PLACE軟件分析順式作用元件,發(fā)現(xiàn)OsPR-4a基因起始密碼子上游1.5 kb的區(qū)域內(nèi)存在幾個可能與PR蛋白基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的順式作用元件,如W盒、PAL-boxA、GT-1結(jié)合序列、Dof結(jié)合序列和MybSt1元件等.將OsPR-4a基因啟動子區(qū)域及其5'部分缺失構(gòu)件與gus報道基因相連,并克隆進(jìn)pCAMBIA1391z載體中,用于分析啟動子活性以及順式作用元件在調(diào)控OsPR-4

5、a基因表達(dá)中的功能.該研究還從水稻受BTH誘導(dǎo)表達(dá)的差減雜交cDNA文庫中,選擇一個預(yù)測編碼β-1,3-葡聚糖酶的差別表達(dá)克隆bihn-n10,以水稻受BTH誘導(dǎo)表達(dá)的全長cDNA文庫DNA為模板,以基因特異引物和載體通用引物,通過PCR克隆了OsGlu的5'缺失端.用已知序列和Genebank搜索的該基因EST序列拼接出OsGlu的全長cDNA.OsGlu的全長cDNA為2034bp,預(yù)測的ORF編碼一個有470個氨基酸組成的蛋白,推