野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因克隆及抗寒相關(guān)功能分析.pdf

1、芭蕉屬（Musa）植物，是熱帶亞熱帶植物，常作為重要觀葉植物廣泛應(yīng)用于園林綠化及景觀布置。但是由于芭蕉屬植物多數(shù)容易受低溫傷害，極大限制了其種植區(qū)域，并且低溫易造成芭蕉葉片干枯黃化、水漬化，大大降低其觀賞性。因此提高芭蕉的抗寒能力，能夠豐富其在園林景觀上的應(yīng)用并提高觀賞價(jià)值。本試驗(yàn)確定了10種芭蕉屬植物資源的低溫半致死溫度，并測定了三明野生蕉的耐受低溫及β-1,3葡聚糖酶活性變化；基于香蕉基因組數(shù)據(jù)庫對(duì)β-1,3葡聚糖酶基因（GSP）家

2、族進(jìn)行功能及進(jìn)化分析；克隆獲得與抗寒相關(guān)的三明野生蕉Mugsps，并分析Mugsps的亞細(xì)胞定位和實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)情況。主要研究如下：
　　1芭蕉屬植物低溫下的生理生化研究
　　1.1低溫下芭蕉屬植物的電解質(zhì)滲出率
　　為比較芭蕉屬植物間的抗寒性差異，本試驗(yàn)選取10種福建省芭蕉屬植物種質(zhì)，采用相對(duì)電導(dǎo)率法，測定低溫下植株葉片的電解質(zhì)滲出率，計(jì)算半致死溫度，并以抗寒性最強(qiáng)的三明野生蕉為材料，測定其能夠耐受的最低溫度。

3、r>　?、僖?0種芭蕉屬植物的葉片為材料，設(shè)置處理溫度為28℃、1℃、0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃，處理時(shí)間為36 h。使用 Logistic方程計(jì)算低溫半致死溫度(LT50)。結(jié)果顯示10種芭蕉屬植物種質(zhì)電解質(zhì)滲出率呈現(xiàn)“S”型變化，計(jì)算出的半致死溫度由高到低為：血蕉（-0.377℃）、北蕉（-0.477℃）、天寶蕉（-0.739℃）、福州野生蕉（-1.086℃）、本地粉蕉（-1.187℃）、柴蕉（-1.204℃）、孟加拉蕉（

4、-1.307℃）、三疊井蕉（-1.389℃）、澳洲粉蕉（-1.559℃）、三明野生蕉（-1.776℃），抗寒總體趨勢為野生蕉高于栽培蕉，試驗(yàn)的結(jié)果為不同氣候地區(qū)選擇適宜種植的觀賞芭蕉植物提供參考。
　?、谝匀饕吧吨仓耆~片為材料，測定其在0℃低溫下處理0h、1h、4h、8h、12h、24 h、5 d、10 d、15 d的電解質(zhì)滲出率。結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的延長，三明野生蕉葉片電解質(zhì)滲出率呈現(xiàn)波浪型上升的趨勢，在處理4 h及24

5、 h時(shí)電解質(zhì)滲出率降低，分別為23.68％（低于對(duì)照24.81%）及25.34%，說明三明野生蕉在0℃處理下經(jīng)歷了兩次抗寒響應(yīng)過程，在處理4h時(shí)三明野生蕉啟動(dòng)了第一次抗寒響應(yīng)，即時(shí)保護(hù)了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，阻止胞內(nèi)物質(zhì)外滲，使得電解質(zhì)滲出率低于對(duì)照，隨著處理時(shí)間延長，細(xì)胞組織不斷受到低溫破壞，在處理24 h時(shí)再次響應(yīng)低溫脅迫，通過產(chǎn)生抗寒相關(guān)功能蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及膜脂保護(hù)酶等調(diào)節(jié)低溫下的細(xì)胞生理狀態(tài)，使得處理5 d后葉片電解質(zhì)滲出率穩(wěn)定在27

6、%左右，說明三明野生蕉經(jīng)過一段時(shí)間的低溫適應(yīng)，已經(jīng)能夠耐受0℃脅迫。
　　1.2低溫下三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶活性變化
　　采摘三明野生蕉植株新葉于13℃、8℃、4℃、0℃、-2℃、-4℃、-6℃下處理36 h，提取粗酶液，以昆布多糖為反應(yīng)底物，采用 DNS法測定還原糖生成量。結(jié)果表明，在13℃芭蕉屬植物的低溫臨界生長溫度下，β-1,3葡聚糖酶活性升高為對(duì)照的1.2倍，隨著處理溫度的降低，β-1,3葡聚糖酶活性呈現(xiàn)“先降

7、低后升高再降低”的表現(xiàn)趨勢，在三明野生蕉半致死溫度附近（-2℃）達(dá)到酶活性高峰，為對(duì)照的1.4倍。試驗(yàn)結(jié)果說明，低溫能夠刺激β-1,3葡聚糖酶在植物響應(yīng)低溫脅迫的幾個(gè)關(guān)鍵溫度提高酶活性，是植物的低溫保護(hù)酶。
　　2基于香蕉基因組數(shù)據(jù)庫的GSP全基因家族功能與進(jìn)化分析
　　植物β-1,3葡聚糖酶（EC.3.2.1.39）屬于糖基水解酶酶第17家族，家族成員數(shù)量眾多，功能復(fù)雜。本試驗(yàn)利用隱馬爾科夫模型根據(jù) GSP特征結(jié)構(gòu)域（Pf

8、am：PF00332）重新搜索本地香蕉基因組（尖葉蕉與長梗蕉）數(shù)據(jù)庫，獲得65條尖葉蕉（M. acuminata）GSPs，剔除尖葉蕉基因組數(shù)據(jù)庫中不含有 GSP特征結(jié)構(gòu)域的序列30條，增加未注釋的GSP序列2條；獲得69條長梗蕉（M. balbisiana）GSPs，剔除長梗蕉基因組數(shù)據(jù)庫中不含有GSP特征結(jié)構(gòu)域序列23條，增加未注釋的GSP序列9條。構(gòu)建尖葉蕉與擬南芥GSP家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，尖葉蕉GSP基因家族可分為α（α1

9、、α2、α3）、β（β1、β2、β3）、γ三大類，α與γ類主要參與植物生長發(fā)育，β類具有PR功能。長梗蕉與尖葉蕉的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，除了長梗蕉“ITC1587 Bchr2 P03966”基因與其他GSP成員的相似性較低獨(dú)自歸為一類δ以外，其余基因均能找到直系同源序列或是相似性很高，說明 GS P家族基因功能在兩個(gè)亞種中保存較完整。對(duì)尖葉蕉GS P家族基因的染色體定位分析表明GS P分布于2-11號(hào)染色體，不具有串聯(lián)重復(fù)序列。研究表明芭蕉科

10、植物經(jīng)歷了三次自身全家族基因復(fù)制事件，計(jì)算尖葉蕉20對(duì)GSPs旁系同源基因?qū)?Ka/Ks值均小于1，推測GSP家族基因在基因組復(fù)制事件后的凈化選擇起著主要作用。
　　3野生蕉抗寒相關(guān)Mugsps的克隆分析
　　以三明野生蕉組培苗為材料，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，以合成的經(jīng)13℃處理36 h的葉片cDNA為模板，采用同源克隆法獲得5條β-1,3葡聚糖酶的cDNA及DNA序列，分別命名為Mugsp1.2、Mugsp2、Mu

11、gsp3、Mugsp4、Mugsp5。序列分析表明：Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5均屬于β1類β-1,3葡聚糖酶基因，cDNA的ORF長度分別為1020、1047、999、1023和960 bp，分別編碼339、348、332、340和319個(gè)氨基酸。Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4均含有1個(gè)內(nèi)含子，而Mugsp3、Mugsp5不具有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，這與尖葉蕉和長梗蕉基因組上的同源基因結(jié)

12、構(gòu)差異較大，將Mugsp1.2同前人克隆獲得的Mugsp（915 bp）和Mugsp1（951 bp）序列比較發(fā)現(xiàn)Mugsp1.2、Mugsp、Mugsp1是來自于同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本，但是只有Mugsp1.2符合GT-AG內(nèi)含子剪切規(guī)則，為該基因的正常轉(zhuǎn)錄本，而Mugsp、Mugsp1則是外顯子缺失型的可變剪接體。生物信息學(xué)預(yù)測表明：除了Mugsp5以外，Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4均具有N端信號(hào)肽。Mu

13、gsp1.2、Mugsp4編碼堿性β-1,3葡聚糖酶，含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；Mugsp2、Mugsp3、Mugsp5編碼酸性β-1,3葡聚糖酶，不具有跨膜結(jié)構(gòu)域；5條Mugsps均含有MAPK等多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，不含有X8、GPI錨定結(jié)構(gòu)域、CTPP結(jié)構(gòu)域及核定位信號(hào)。因此推測Mugsp1.2、Mugsp4屬于Ⅱ型跨膜蛋白，而Mugsp2、Mugsp3、Mugsp5屬于膜周邊蛋白，Mugsps（Mugsp1.2~Mugsp5）可能屬于一類新

14、的PR相關(guān)β-1,3葡聚糖酶基因，并參與了MAPK抗寒調(diào)控途徑。
　　4野生蕉抗寒相關(guān)Mugsps的亞細(xì)胞定位分析
　　為探究Mugsps在低溫下的作用機(jī)制，本試驗(yàn)對(duì)克隆獲得的其中3個(gè)β-1,3葡聚糖酶基因（Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4）進(jìn)行了常溫及低溫下的亞細(xì)胞定位觀察。將 Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4的完整 ORF序列同 pCAMBIAl302-GFP構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體，獲得35S-Mu

15、gsp1.2-GFP、35S-Mugsp2-GFP、35S-Mugsp4-GFP重組質(zhì)粒，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染洋蔥表皮細(xì)胞，將侵染的洋蔥表皮材料，一部分置于常溫培養(yǎng)后使用共聚焦成像儀觀察亞細(xì)胞定位，另一部分轉(zhuǎn)移到8℃低溫下繼續(xù)培養(yǎng)后，使用1μg/mLDAPI染色后再進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀察。觀察結(jié)果表明：常溫下Mugsp1.2-GFP、Mugsp2-GFP、Mugsp4-GFP蛋白主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)上，GFP空載體蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、

16、細(xì)胞膜、細(xì)胞間隙處均有分布，8℃低溫處理后Mugsp1.2-GFP、Mugsp2-GFP、Mugsp4-GPF融合表達(dá)載體的綠色熒光信號(hào)除了分布在液泡膜、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)外，還分布在細(xì)胞核。推測低溫下膜蛋白Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4感受低溫信號(hào)后，通過結(jié)合某些鈣調(diào)蛋白或者通過磷酸化作用，將抗寒信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及下游功能基因的表達(dá)。
　　5野生蕉抗寒相關(guān)Mugsps低溫處理下的熒光定量表達(dá)分析
　

17、　為進(jìn)一步研究Mugsps在低溫下的抗寒機(jī)理，本試驗(yàn)以三明野生蕉組培苗為材料，以18s為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測Mugsp、Mugsp1、Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4、Mugsp57個(gè)基因在低溫下的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明：
　?、僭?8℃、20℃、13℃、4℃、0℃、-2℃、-4℃、-6℃不同溫度處理36 h下：隨著處理溫度的降低，Mugsps均能響應(yīng)低溫脅迫改變表達(dá)量，但是成員間的表

18、達(dá)水平存在差異：Mugsp2表現(xiàn)為“先升高后降低”的趨勢，只有一個(gè)表達(dá)高峰，在4℃時(shí)表達(dá)量最高，為常溫對(duì)照的3.5倍，其余基因（Mugsp、Mugsp1、Mugsp1.2、Mugsp3、Mugsp4、Mugsp5）則呈現(xiàn)“M”型的表達(dá)趨勢，有兩個(gè)表達(dá)高峰，其中Mugsp、Mugsp1.2、Mugsp5分別在13℃及4℃時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，表達(dá)量為常溫的1.7、2.1、0.8及2.5、2.2、1.4倍左右，而Mugsp1、Mugsp3、Mug

19、sp4在13℃及0℃表達(dá)量達(dá)到最高，分別為常溫的2.0、0.8、0.6及2.7、5.0、4.5倍左右。總體上，Mugsp1、Mugsp1.2、Mugsp3對(duì)溫度變化響應(yīng)劇烈，表達(dá)量較高，推測起著更關(guān)鍵的抗寒作用。定量結(jié)果與不同溫度下β-1,3葡聚糖酶活性的表現(xiàn)趨勢基本一致，說明低溫下Mugsps能夠協(xié)同翻譯成β-1,3葡聚糖酶協(xié)助植株抵抗低溫脅迫。
　　②常溫28℃、8℃及8℃低溫下噴施0.5 mmol/L SA分別進(jìn)行1 h、4

20、 h、8 h、12 h、24 h處理后：8℃低溫下，Mugsps均能相繼在1~4 h內(nèi)提高表達(dá)量，其中Mugsp、Mugsp1、Mugsp1.2在低溫處理1 h時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，而Mugsp2、Mugsp4、Mugsp5在處理4 h時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，說明Mugsps能夠快速響應(yīng)低溫脅迫，；8℃噴施SA處理則會(huì)推遲Mugsps的表達(dá)，使得 Mugsp、Mugsp1、Mugsp1.2在處理12 h時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，而此時(shí)Mugsp2、Mugsp4

21、、Mugsp5表達(dá)量才開始升高，并在24 h表達(dá)量顯著提高，推測低溫下Mugsps可能參與了抗寒傳導(dǎo)途徑早期的上游調(diào)控，而低溫 SA處理延緩了細(xì)胞膜受到的低溫傷害，使得 Mugsps因未能感受到膜變化而推遲表達(dá)。綜上所述，三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因Mugsps在8℃低溫刺激下，可能通過與MAPK的磷酸化作用作為抗寒途徑的上游信號(hào)傳導(dǎo)因子，在1~4 h短時(shí)間內(nèi)迅速提高基因表達(dá)量，將抗寒信號(hào)快速從細(xì)胞膜傳遞至細(xì)胞核，起著抗寒傳導(dǎo)途徑中