NDV La Sota與V4株對雞T細胞亞群影響及其F蛋白抗原優(yōu)勢表位的比較研究.pdf

1、該研究應用親水性、可及性和二級結(jié)構預測等5種參數(shù)對新城疫LaSota和V4株F蛋白的B細胞抗原表位進行了綜合預測;采用Margalit的AMPHI法則等3種預測方案對La Sota、V4株的F蛋白T細胞抗原表位進行了綜合預測.預測到二者的F蛋白B細胞抗原表位分別有19個,T細胞抗原表位有24個.比較發(fā)現(xiàn),兩個毒株有9個預測的B細胞表位氨基酸序列存在差異,有11個預測的T細胞表位氨基酸序列存在差異.在此預測結(jié)果基礎上,我們進行了表位的鑒定

2、、篩選和比較研究.首先利用RT-PCR方法擴增并克隆了中國目前使用的NDV La Sota疫苗株F基因全序列,其包含了F基因完整的開放閱讀框架(全長1662bp),與國外發(fā)表的La Sota疫苗株F基因核苷酸序列同源性高達99.8﹪.將兩毒株F基因預測存在差異的表位,根據(jù)序列位置鄰近合并分成6段表位區(qū),以構建的La Sota疫苗株F基因和該課題保存的V4株F基因為模板,分別對每個毒株的6段表位區(qū)進行了亞克隆,構建了每個毒株的6個預測區(qū)的

3、表達載體,對每個毒株的5個預測區(qū)進行了表達.5段多肽的大小分別是,P1:8.0KD、P2:10.8KD、P4:11.6KD、P5:13.5KD、P6:10.5KD.應用建立的Tricine緩沖體系5﹪-20﹪線性梯度聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳對表達情況進行了分析,證明所表達的肽段主要以包涵體形式存在,并成功地用Ni-NTA膠對其進行了純化.分別應用自制的La Sota與V4特異性抗血清,利用Western Blot對表達的各肽段(P1-P6

4、)進行了抗原性鑒定.結(jié)果P1、P4、P5、P6段呈陽性反應,說明其中含有線性B細胞表位.這4段分別位于F蛋白的1-48aa、201-274aa、377-458aa、469-530aa,以前發(fā)現(xiàn)的中和性表位均不在這4段區(qū)域內(nèi).而P2段在Western Blot中無抗體反應性,表明它不含線性表位.比較研究發(fā)現(xiàn)NDV La Sota與V4株的P1、P4區(qū)的B細胞表位活性存在著重要的差異,這兩段分別存在于F1、F2蛋白上距離融合肽均較近的超螺旋

5、區(qū),這種差異可能造成兩個毒株的免疫原性差異.該試驗結(jié)果首次對NDV La Sota P5與V4株的細胞免疫和抗原表位差異進行了全面系統(tǒng)的比較研究,證實了V4疫苗株激發(fā)細胞免疫應答的功能優(yōu)于La Sota,闡明了兩疫苗免疫特點不同的理論基礎,并初步證實產(chǎn)生免疫原性差異的分子基礎在于抗原表位的不同,為進一步精細的研究兩個毒株的抗原表位、找到二者優(yōu)勢抗原表位的差異,以探索二者免疫機制的不同,研制集合兩毒株不同優(yōu)勢表位特點的表位DNA疫苗奠定了