10024.grks和βarrestins在gpcrs信號轉(zhuǎn)導中作用的實驗研究

1、分類號：Q331校單位代碼：10446碩士學位論文論文題目：論文題目：GRKs和βarrestins在GPCRs信號轉(zhuǎn)導中作用的信號轉(zhuǎn)導中作用的實驗研究實驗研究研究生姓名：田艷君學科、專業(yè)：生物化學與分子生物學研究方向：分子生物學導師姓名、職稱：白波教授陳京教授論文完成時間：2014年4月曲阜師范大學2014屆碩士研究生畢業(yè)論文Ⅰ摘要G蛋白偶聯(lián)受體（GproteincoupledreceptsGPCRs）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的細胞表面受

2、體超家族，可將多種細胞外物理性和化學性信號傳遞至細胞內(nèi)，并通過與其它信號轉(zhuǎn)導通路相互作用來調(diào)控各種生理功能。配體與GPCRs結(jié)合后，不僅能激活異源三聚體G蛋白，還可以引發(fā)G蛋白偶聯(lián)受體激酶（GproteincoupledreceptkinasesGRKs）參與GPCRs的磷酸化。通常情況下，抑制蛋白（βarrestins）會迅速與磷酸化的GPCRs結(jié)合，削弱受體通過G蛋白對刺激物的應答作用。本實驗擬以孤啡肽受體（opioidrecept

3、like1receptL1）及apelin受體（putativereceptproteinrelatedtoAT1APJ）為主要研究對象，分析GPCRs調(diào)節(jié)因子GRKs和βarrestins在這兩種受體信號轉(zhuǎn)導中的作用，探討GPCRs信號轉(zhuǎn)導的作用途徑和作用機制，為臨床治療提供新的策略和藥物靶點積累資料。本實驗采用分子克隆方法構(gòu)建含人L1、APJ及其突變體以及GRKs的各種真核表達載體，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞（HEK293T細胞），利用生物發(fā)

4、光共振能量轉(zhuǎn)移（biolumininescenceresonanceenergytransferBRET）、激光共聚焦掃描顯微鏡等技術(shù)實時、動態(tài)地研究活細胞中GRKs、βarrestins與L1、APJ的相互作用特點。同時，借助酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzymelinkedimmunosbentassayELISA）檢測細胞表面受體表達水平，分析配體誘導的受體內(nèi)化的特點?；驕y序證實，一系列的重組真核表達質(zhì)粒，包括L1Venus、L1Rlu

5、c、EGFPL1、GRK23Rluc以及APJ突變體APJS335ARluc、APJS345ARluc、APJS348ARluc、HAAPJS348A等均構(gòu)建正確，可用于細胞轉(zhuǎn)染。經(jīng)BRET檢測，給予L1特異性激動劑NOFQ后，L1既可以與Gαio結(jié)合，又能與GRK3、βarrestin2產(chǎn)生相互作用，但與細胞膜定位蛋白Kras（KRas）的作用則會明顯減弱。BRET2結(jié)果顯示，在apelin13作用下，野生型APJ與GRK2和GRK5

6、均可發(fā)生相互作用，突變體APJS335A和APJS345A出現(xiàn)與野生型類似的效應；而APJS348A與GRK2和GRK5均不能產(chǎn)生BRET信號。ELISA實驗表明：采用NOFQ處理細胞30min后，細胞表面L1水平降低，尤其當GRK3或βarrestin2存在時，L1受體水平降低更加顯著（p＜0.01），L1出現(xiàn)明顯內(nèi)化；采用apelin13孵育細胞30min后，野生型APJ出現(xiàn)明顯內(nèi)化，當βarrestins存在時內(nèi)化更顯著；但突變體

7、APJS348A，即便有βarrestins的存在，也未發(fā)現(xiàn)明顯的內(nèi)化現(xiàn)象。采用BRET技術(shù)研究L1和APJ的信號轉(zhuǎn)導特點時發(fā)現(xiàn)，L1和APJ存在BRET現(xiàn)象，可形成二聚體，結(jié)果顯示此二聚化是配體非依賴性的。激光共聚焦顯微鏡技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluescenceresonanceenergytransferFRET）檢測也得到了一致的結(jié)果。實驗結(jié)果提示，激動劑作用下，GPCRs不僅可以通過G蛋白依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮作用，還可經(jīng)由