Lck激酶在L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用研究.pdf

1、血液中白細(xì)胞被血管內(nèi)皮細(xì)胞捕獲、沿著血管內(nèi)皮細(xì)胞滾動(dòng)、穩(wěn)定粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞上、跨血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移并最終到達(dá)炎癥部位是一個(gè)受嚴(yán)格調(diào)控的復(fù)雜多步驟的過(guò)程。至少有三類粘附分子家族在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中選擇素家族分子主要參與了白細(xì)胞捕獲和沿血管內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動(dòng)過(guò)程。L-選擇素是選擇素家族成員之一，組成性地表達(dá)在白細(xì)胞微絨毛頂端，是白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用過(guò)程中最先行使功能的分子。除了作為粘附分子發(fā)揮作用，L-選擇素還作為信號(hào)分子在

2、白細(xì)胞粘附過(guò)程中起始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。L-選擇素與單克隆抗體的結(jié)合能夠引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞形態(tài)改變、氧呼吸爆發(fā)以及細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-8基因表達(dá)上調(diào)等一系列生理事件。但L-選擇素是如何利用胞內(nèi)蛋白傳遞信號(hào)并引發(fā)一系列生理變化的，其具體機(jī)制仍不清楚。Lck激酶是非受體蛋白酪氨酸激酶Src家族的成員之一，特異性地在T淋巴細(xì)胞中表達(dá)，并且在T淋巴細(xì)胞的活化及發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。L-選擇素與其單克隆抗體的交聯(lián)能夠活化Lck激酶，

3、我們推測(cè)，Lck激酶不僅參與了L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。本文主要探討了Lck激酶是如何調(diào)控sulfatides交聯(lián)L-選擇素后引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的。 我們發(fā)現(xiàn)，在JurkatT細(xì)胞中，sulfatides與L-選擇素的交聯(lián)能夠引起Lck激酶快速?gòu)?qiáng)烈的酪氨酸磷酸化，而且Lck激酶的特異性抑制劑PP2不僅阻斷了L-選擇素交聯(lián)引起的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排過(guò)程，而且還顯著抑制了L-選擇素介導(dǎo)的JurkatT細(xì)胞在人臍靜脈

4、內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動(dòng)，說(shuō)明Lck激酶不僅位于L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，而且對(duì)于L-選擇素信號(hào)的傳遞起著關(guān)鍵性作用。通過(guò)與L-選擇素胞漿尾部的直接結(jié)合，Lck激酶能夠在活化之后快速地磷酸化L-選擇素胞漿尾部，增強(qiáng)L-選擇素信號(hào)。L-選擇素胞漿尾部唯一的酪氨酸位點(diǎn)，Tyr372，在L-選擇素與Lck激酶的直接結(jié)合中發(fā)揮重要作用，因?yàn)檫@一位點(diǎn)的突變顯著抑制了二者的結(jié)合。在sulfatides交聯(lián)一段時(shí)間后，L-選擇素與Lck激酶的結(jié)合能力減弱，也

5、就是說(shuō)這個(gè)時(shí)候的Lck激酶已經(jīng)開(kāi)始從L-選擇素的胞漿尾部解離。我們認(rèn)為，正是由于這種蛋白結(jié)合的動(dòng)態(tài)性，才使得L-選擇素能夠通過(guò)其只有17個(gè)氨基酸的胞漿尾部與多種胞內(nèi)信號(hào)蛋白結(jié)合，傳遞多種信號(hào)。 通過(guò)其SH3和SH2結(jié)構(gòu)域與c-Ab1激酶和ZAP-70激酶的直接結(jié)合，Lck激酶在L-選擇素胞漿尾部形成了一個(gè)大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體。在L-選擇素交聯(lián)活化后，Lck激酶先于c-Ab1激酶活化。Lck激酶的特異性抑制劑PP2能夠顯著抑制c-A

6、b1激酶的磷酸化水平和激酶活性，同時(shí)明顯降低ZAP-70激酶的整體和Tyr319酪氨酸磷酸化水平，甚至連本底水平也都受到影響。而c-Ab1激酶的特異性抑制劑STI571與ZAP-70激酶的特異性抑制劑Piceatannol則對(duì)Lck激酶的磷酸化沒(méi)有任何作用。這些結(jié)果說(shuō)明，在L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Lck激酶是最先被活化的激酶，并通過(guò)影響下游c-Ab1激酶和ZAP-70激酶的活性而傳遞L-選擇素信號(hào)。 當(dāng)干涉胞內(nèi)Lck激酶表達(dá)后

7、，L-選擇素信號(hào)被顯著抑制。不僅L-選擇素、c-Ab1激酶和ZAP-70激酶的酪氨酸磷酸化水平明顯降低，細(xì)胞在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動(dòng)也相應(yīng)地受到影響。轉(zhuǎn)入野生型或激酶永久活化型而非激酶永久失活型鼠Lck表達(dá)質(zhì)粒能夠補(bǔ)償內(nèi)源Lck激酶干涉造成的蛋白磷酸化水平缺失和細(xì)胞滾動(dòng)減少，說(shuō)明Lck激酶的激酶活性對(duì)于L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是十分重要的。SH2結(jié)構(gòu)域突變型質(zhì)粒不能夠恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化的水平，但卻部分地補(bǔ)償細(xì)胞滾動(dòng)減少，而SH3結(jié)構(gòu)域突變

8、型質(zhì)粒的作用卻正好相反，這些結(jié)果說(shuō)明Lck激酶的sH3和SH2結(jié)構(gòu)域行使不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。 本文結(jié)果表明，在L-選擇素交聯(lián)引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中，Lck激酶起到了關(guān)鍵性的作用。它不僅通過(guò)與L-選擇素胞漿尾部的直接結(jié)合，接受并增強(qiáng)L-選擇素信號(hào)，還能通過(guò)與行使不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的SH3和SH2結(jié)構(gòu)域與下游c-Ab1激酶和ZAP-70激酶直接結(jié)合，進(jìn)而將L-選擇素信號(hào)快速有效地向下游傳遞。同時(shí)，與Lck激酶的動(dòng)態(tài)結(jié)合使得L-選擇素胞漿