NK細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中KCTD9與SHB作用研究.pdf

1、目的：
　　我國(guó)是HBV感染的高發(fā)地區(qū)，1-59歲人群攜帶率約7.18％，由HBV感染導(dǎo)致的重型肝炎或肝功能衰竭是我國(guó)臨床常見(jiàn)急危重疾病。由于缺乏有效的治療手段，除非實(shí)施肝移植，大部分患者預(yù)后不良，并發(fā)癥多。重型乙型肝炎發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是病毒和宿主的相互作用的結(jié)果，HBV感染后機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)引起的肝損傷可能是重型肝炎發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié)。本研究室的前期研究首次揭示肝臟NK細(xì)胞在病毒誘導(dǎo)的肝損傷中發(fā)揮著重要作用。
　　在本

2、實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，利用人全基因組芯片技術(shù)分析重型乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)的基因差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)鉀離子通道相關(guān)基因KCTD9(Potassium Channel Tetramerisation Domain Containing9)在重型肝炎中表達(dá)明顯增高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)KCTD9分子在重型肝炎患者淋巴細(xì)胞胞核中高表達(dá)，提示其表達(dá)水平與病毒性乙型肝炎疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。后續(xù)研究表明KCTD9主要表

3、達(dá)在重型肝炎患者肝組織和外周血的NK細(xì)胞。初步體外實(shí)驗(yàn)研究顯示KCTD9分子可促進(jìn)NK92細(xì)胞的活化并增強(qiáng)細(xì)胞的功能。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，KCTD9分子與新型接頭蛋白SHB(Src homology2 domain containing adaptor protein B)分子具有緊密的功能關(guān)聯(lián)，而SHB分子與IL-2受體信號(hào)途徑和PI3K途徑相關(guān)。為此，推測(cè)KCTD9分子可能通過(guò)與SHB分子結(jié)合參與NK細(xì)胞的活化過(guò)程。本研究的目的

4、是通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證KCTD9分子和SHB分子之間是否存在相互作用，同時(shí)建立穩(wěn)定表達(dá)KCTD9基因的NK92單克隆細(xì)胞系，為研究?jī)?nèi)源性KCTD9分子參與NK細(xì)胞的活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1．利用pHA-KCTD9和pFlag-SHB真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，通過(guò)免疫共沉淀驗(yàn)證KCTD9與SHB分子的相互作用。
　　2．利用pGC-FU-KCTD9-3FLAG慢病毒載體感染NK92細(xì)胞，通過(guò)

5、嘌呤霉素反復(fù)篩選出穩(wěn)定的陽(yáng)性克隆細(xì)胞，并采用有限稀釋法挑選單克隆細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)KCTD9的NK92單克隆細(xì)胞系。通過(guò)Western Blot檢測(cè)KCTD9的表達(dá)；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK92 KCTD9單克隆細(xì)胞活化/抑制性受體表達(dá)譜；ELISA法檢測(cè)此細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌情況。
　　結(jié)果：
　　1．免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)KCTD9與SHB分子之間存在相互作用。
　　2．成功建立穩(wěn)定表達(dá)KCTD9的NK92單

6、克隆細(xì)胞系，通過(guò)Western Blot證實(shí)了KCTD9的表達(dá)。表達(dá)NKG2A、NKp44和NKp46的NK92 KCTD9單克隆細(xì)胞比例顯著下降。NK92 KCTD9單克隆細(xì)胞表達(dá)NKG2A、NKp44的平均熒光強(qiáng)度下降，表達(dá)NKG2C、NKG2D和NKp46的平均熒光強(qiáng)度上升。細(xì)胞因子IFN-γ分泌增加。
　　結(jié)論：
　　1．體外實(shí)驗(yàn)初步推斷KCTD9蛋白與SHB蛋白之間存在相互作用，KCTD9分子可能通過(guò)與SHB分子結(jié)