α7 nAChR在尼古丁相關(guān)性牙周炎中的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究.pdf

1、牙周炎是口腔常見病、高發(fā)病，可引起牙周組織降解、牙周袋形成、進行性附著喪失和牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒松動脫落或被拔除，是成人牙齒喪失的首要原因。吸煙者牙周炎的患病率高、病情重、治療效果和預(yù)后差，其具體機制卻不清楚?，F(xiàn)已證實，尼古丁作為煙草中的主要毒性物質(zhì)，在吸煙對牙周組織的破壞過程中發(fā)揮重要作用。然而，尼古丁究竟通過何種途徑對牙周組織產(chǎn)生破壞作用，目前尚不明了。
　　課題組前期研究表明，體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞中功能性表達(dá)α7nACh

2、R；本人前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠牙周組織中存在尼古丁靶受體：α7型尼古丁乙酰膽堿受體(alpha7nicotinicacetylcholinereceptor,α7nAChR)的mRNA和蛋白表達(dá)，尼古丁可明顯上調(diào)該受體的表達(dá)，且α7nAChR表達(dá)調(diào)節(jié)與大鼠牙周組織破壞、牙槽骨吸收程度密切相關(guān)。然而，尼古丁激活α7nAChR后如何對牙周組織產(chǎn)生破壞作用？其分子機制是什么？目前尚未見相關(guān)報道。
　　目的：本課題采用尼古丁作用下人牙周膜細(xì)胞和

3、實驗性牙周炎大鼠為模型，觀察α7nAChR對體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞增殖、貼附與遷移等生物學(xué)特
　　性的調(diào)控，以及對牙周膜細(xì)胞和牙周組織分泌牙周炎相關(guān)炎性介質(zhì)的影響，并進一步篩選和探明α7nAChR激活后下游關(guān)鍵分子信號通路，以期闡明α7nAChR在吸煙促進牙周炎發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色及其作用機制。
　　材料與方法：體外研究，培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，并分別給予α7nAChR激動劑尼古?。?.1-10μM）和/或拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素（α

4、-bungarotoxin,α-BTX,10nM）；及ERK1/2信號通路抑制劑U0126(10μM)、P38信號通路抑制劑SB203580(10μM),JNK信號通路抑制劑SP600125(10μM)和PI3K信號通路抑制劑LY-294,002(10-5μM)處理。分別采用WST-1、貼附實驗和劃痕修復(fù)實驗測定細(xì)胞增殖、貼附與遷移能力改變；采用實時定量PCR、免疫熒光染色和Westernblot等實驗檢測各組細(xì)胞α7nAChR、IL-

5、1β、IL-6、TNF-α、RANKL和OPG等基因和蛋白表達(dá)，及ERK1/2和p-ERK1/2等磷酸化信號通路蛋白表達(dá)情況。
　　體內(nèi)研究，24只SD大鼠采用兩次完全隨機分組方法分為4組，每組6只；采用3-0絲線結(jié)扎上頜左側(cè)或右側(cè)第二磨牙頸部，對側(cè)不予結(jié)扎，作為自身對照；次日起分別給予生理鹽水、尼古丁1.62mg/kg/d、α-BTX10μg/kg/d、α-BTX（10μg/kg/d）+30分鐘后尼古?。?.62mg/kg/d）

6、腹腔注射，常規(guī)飼養(yǎng)。全部大鼠于結(jié)扎前行麻醉下活體顯微CT頭部掃描，并分別于給藥后7、14、21和28天行活體顯微CT頭部掃描；采用Tri-Bon影像分析系統(tǒng)，重建各組大鼠顱頜面及牙體牙周組織影像；采用嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化定位方法，創(chuàng)建一種基于“四根定位”的新型牙槽骨定量分析策略；定量分析各組大鼠牙槽骨骨密度、骨小梁厚度、骨體積分?jǐn)?shù)等參數(shù)的動態(tài)改變；各組大鼠于給藥后28天取材，解剖取出雙側(cè)上頜磨牙區(qū)組織，制作牙體牙周聯(lián)合切片；HE染色進行病理學(xué)觀

7、察；免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠牙周組織α7nAChR、IL-1β、IL-6、TNF-α等蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：體外研究，實時定量PCR結(jié)果表明，10μM尼古丁作用下人牙周膜細(xì)胞α7nAChR基因表達(dá)明顯上調(diào)，約為對照組的4.7倍(P<0.001)；α-BTX+尼古丁處理組α7nAChR基因表達(dá)水平與對照組近似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；免疫熒光染色和Westernblot結(jié)果證實，體外培養(yǎng)正常人牙周膜細(xì)胞中α7nAChR蛋白呈陽性表達(dá)；

8、與對照組相比，尼古丁處理組α7nAChR表達(dá)增強，α-BTX預(yù)處理可拮抗尼古丁對α7nAChR表達(dá)的上調(diào)作用；α7nAChR激活可抑制細(xì)胞增殖和貼附，而促進其遷移。
　　體內(nèi)研究，尼古丁作用下大鼠α7nAChR表達(dá)明顯上調(diào)，與之相對應(yīng)的是，牙槽骨吸收亦明顯加重，而α-BTX預(yù)處理可拮抗尼古丁的作用；尼古丁單獨作用下，大鼠牙槽骨顯微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)慢性破壞，其特征為首先出現(xiàn)骨小梁厚度降低且骨小梁分離度升高，后期出現(xiàn)骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁數(shù)目降低

9、；尼古丁給藥結(jié)合絲線結(jié)扎可造成大鼠牙槽骨急劇喪失。
　　體內(nèi)和體外研究均顯示，尼古丁作用下人牙周膜細(xì)胞或大鼠牙周組織中α7nAChR表達(dá)上調(diào)的同時，IL-1β、IL-6、TNF-α和RANKL表達(dá)亦明顯增強且OPG表達(dá)減弱；而ERK1/2和PI3K信號通路抑制劑可顯著降低IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)；尼古丁作用下人牙周膜細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平明顯增高。
　　結(jié)論：本研究證實α7nAChR在體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞中

10、存在功能性表達(dá)；發(fā)現(xiàn)尼古丁可通過作用于α7nAChR調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞增殖、貼附和遷移等生物學(xué)特性；人牙周膜細(xì)胞α7nAChR激活后可通過作用于下游ERK1/2和PI3K信號通路影響IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子分泌而參與牙周組織的炎癥反應(yīng)和牙槽骨吸收過程；大鼠牙周組織α7nAChR激活可通過特定模式動態(tài)調(diào)控牙槽骨的顯微結(jié)構(gòu)改變。本研究表明尼古丁可通過作用于α7nAChR而激活下游ERK1/2和PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而參與