重組人腦鈉肽(rhBNP)新藥物分子的設(shè)計(jì)、制備及生物活性分析.pdf

1、人腦鈉肽(hBNP)是心力衰竭時(shí)人體分泌的作為代償功能的一種內(nèi)源性多肽。hBNP與其特異性鈉尿肽受體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高和平滑肌舒張，改善患者的癥狀。hBNP的藥用價(jià)值已被肯定，但因其穩(wěn)定性差、生物利用度低，體內(nèi)半衰期僅為18min，提示需以hBNP為藥物前體，設(shè)計(jì)其成藥分子，促進(jìn)hBNP分子的藥物化。本論文采用人血清白蛋白(HSA)融合技術(shù)設(shè)計(jì)了4種重組人腦鈉肽(rhBNP)新藥物分子—HSA融合rhBNP(rhBNP-H

2、SA)，并對其制備方法進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 針對hBNP分子量小，易被腎臟排泄、成藥性差的缺陷，設(shè)計(jì)了4種HSA融合rhBNP新藥物分子。通過基因重組技術(shù)，構(gòu)建了4種新藥物分子的融合基因，分別為hsa-(bnp)2、bnp-hsa、(bnp)2-hsa和(bnp)4-hsa，并插入到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，獲得了融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　 電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，篩選獲得高表達(dá)融合蛋白菌

3、株(GS115/pPIC9K-hsa-(bnp)2，156 mg/l；GS115/pPIC9K-bnp-hsa，212 mg/l；GS115/pPIC9K-(bnp)2-hsa，161 mg/L；GS115/pPIC9K-(bnp)4-hsa，47mg/l)。搖瓶發(fā)酵的優(yōu)化條件研究確定發(fā)酵步驟為：菌株接種于YPD培養(yǎng)基，30℃，200 r/min培養(yǎng)28 h，靜置沉降，菌體沉淀復(fù)溶于含2％甲醇的BMMY培養(yǎng)基，體積濃縮1.5倍，30℃，

4、200 r/min搖床誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加2％甲醇，誘導(dǎo)72h后收獲目的蛋白。
　　 建立了融合蛋白分離純化的技術(shù)路線：發(fā)酵液離心后用截留分子量為10 kDa的biomax超濾膜濃縮20倍，Blue Sepharose親和層析聚集HSA融合分子，產(chǎn)品純度達(dá)到治療性生物制品的要求(純度≥95％)，蛋白回收率≥56％。
　　 建立了rhBNP細(xì)胞活性分析法，通過定量分析小鼠單核/巨噬細(xì)胞Raw264.7中iNOS和TNF

5、αmRNA水平的抑制強(qiáng)度，來判斷rhBNP活性高低，發(fā)現(xiàn)HSA-(BNP)2有較高的生物活性。體內(nèi)降壓實(shí)驗(yàn)也證明HSA-(BNP)2有一定的降壓作用。
　　 建立了超微量檢測融合蛋白HSA-(BNP)2完整分子的雙抗夾心ELISA方法，其檢測范圍在0.625～200μg/ml之間。初步應(yīng)用于嚙齒類小鼠藥代動(dòng)力學(xué)rhBNP融合蛋白HSA-(BNP)2血藥濃度分析，其血漿半衰期為2.14 h，與BNP單體在小鼠血漿中的半衰期3.1